1、2006年8月,Yamanaka小組將24種轉(zhuǎn)錄因子基因排列組合導(dǎo)入小鼠成纖維細(xì)胞,最終確定最少有4種轉(zhuǎn)錄因子組合-Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4即可將成纖維細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)性多潛能干(iPS)細(xì)胞,2007年11～12月,Yamanaka小組和Thomson小組先后將人的體細(xì)胞重編程為iPS細(xì)胞。這之后iPS細(xì)胞的研究和關(guān)注度呈爆炸式增長(zhǎng),且取得了一些突破性進(jìn)展,如建立了疾病特異的人iPS細(xì)胞、借助轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法高效
2、制備了virus-free iPS細(xì)胞以及成功地從所獲得的iPS細(xì)胞中移除先前導(dǎo)入的轉(zhuǎn)錄因子基因。在利用特定小分子化合物的情況下,更少的外源基因?qū)爰纯筛咝诗@得iPS細(xì)胞,這向制備無(wú)遺傳修飾的iPS細(xì)胞方面邁出了一大步；此外,亦建立了大鼠和猴等的iPS細(xì)胞系,這些成績(jī)將iPS細(xì)胞在臨床上的實(shí)際應(yīng)用又大大向前推進(jìn)了一步,iPS細(xì)胞研究和應(yīng)用將有望成為21世紀(jì)最偉大的醫(yī)學(xué)生物學(xué)成就之一。
研究腫瘤細(xì)胞重編程的經(jīng)典方法有:①利
3、用胚胎微環(huán)境,②囊胚腔注射,③利用胚胎干細(xì)胞生長(zhǎng)微環(huán)境。iPS細(xì)胞技術(shù)的問世為研究腫瘤細(xì)胞重編程提供了一種新的思路和手段。利用Oct4、Sox2、C-myc和Klf4即可將腫瘤細(xì)胞重編程,2009年7月Hochedlinger課題組用Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4將小鼠黑色素瘤細(xì)胞重編程為iPS細(xì)胞。iPS技術(shù)為在體外研究腫瘤細(xì)胞重編程提供了重要的技術(shù)平臺(tái),為研究腫瘤發(fā)病機(jī)制及腫瘤治療等方面提供一種新思路。
本課
4、題借助慢病毒基因投遞法將Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc四種基因?qū)肴似つw成纖維(CCD)細(xì)胞,進(jìn)而將其重編程為iPS細(xì)胞,從而實(shí)現(xiàn)以下目的:①為體外研究腫瘤細(xì)胞重編程構(gòu)筑技術(shù)平臺(tái)；②為后續(xù)研究[如iPS細(xì)胞生物學(xué)特性和行為(如自我復(fù)制、增殖和分化等)調(diào)控機(jī)制研究]奠定基礎(chǔ)。
目的:
借助慢病毒載體法將Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc四種基因?qū)隒CD細(xì)胞,進(jìn)而將其重編程為iPS細(xì)胞,以實(shí)現(xiàn)多
5、種目的(見上)。
方法:
1)攜帶Oct4、Sox2、C-Myc和Klf4基因的慢病毒載體鑒定
酶切鑒定分別用BamHI/KpnI和EcoR I/EcoR V進(jìn)行酶切,酶切產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳。
PCR鑒定根據(jù)Oct4、Klf4、c-Myc和Sox2序列設(shè)計(jì)引物分別擴(kuò)增Oct4、Klf4、c-Mye和Sox2基因；PCR擴(kuò)增后,取5μl反應(yīng)液進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳。
6、 2)慢病毒生產(chǎn)與滴度測(cè)定
慢病毒包裝按標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行慢病毒包裝(脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染)。
慢病毒滴度測(cè)定用5μl病毒上清感染15萬(wàn)293T細(xì)胞,48h后4％多聚甲醛固定,DAPI染色,熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)EGFP陽(yáng)性細(xì)胞和總細(xì)胞數(shù),將其帶入公式:病毒滴度(IU/ml)=EGFP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)÷5×1.5×105x103。
3)慢病毒載體法重編程CCD細(xì)胞為iPS細(xì)胞
a)取一定量
7、的病毒上清過濾后懸浮感染CCD細(xì)胞。
b)病毒感染24小時(shí)后,將CCD細(xì)胞消化鋪于feeder細(xì)胞上,換為hES細(xì)胞培養(yǎng)基,第十天開始換為條件培養(yǎng)基。
c)20天左右開始挑取克隆,選擇AP陽(yáng)性細(xì)胞繼續(xù)后續(xù)工作。
4)人iPS細(xì)胞建系及其生物學(xué)特性鑒定
a)iPS細(xì)胞克隆形態(tài)觀察；
b)細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)人ES細(xì)胞標(biāo)志性抗原表達(dá)；
c)提取iPS細(xì)胞總RNA
8、,進(jìn)而RT-PCR檢測(cè)人ES細(xì)胞標(biāo)志性基因表達(dá)；
d)人iPS細(xì)胞核型分析；
e)懸浮培養(yǎng)觀察擬胚體形成及體外分化；
f)iPS細(xì)胞接種至SCID小鼠皮下,觀察畸胎瘤形成及體內(nèi)分化情況。
結(jié)果:
1)攜帶Oct4、Sox2、C-Myc和Klf4基因的慢病毒載體鑒定
酶切鑒定攜帶Oct4、Sox2、C-Myc和Klf4基因的慢病毒載體分別經(jīng)BamHI/Kp
9、n和EcoR I/EcoR V酶切,酶切產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳均可見兩條預(yù)期大小的條帶。
PCR鑒定分別以攜帶Oct4、Sox2、C-Myc和Klf4基因的慢病毒載體為模板,擴(kuò)增Oct4、Klf4、c-Myc和Sox2基因,PCR產(chǎn)物大小均與預(yù)期值相符。
2)慢病毒生產(chǎn)與滴度測(cè)定
攜帶Oct4、Sox2、C-Mye和Klf4基因的慢病毒載體與病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,24h后倒置熒光顯微
10、鏡下可見綠色熒光,預(yù)示轉(zhuǎn)染成功。按照上述方法進(jìn)行慢病毒滴度測(cè)定,病毒滴度值都在1×106 IU/ml以上。
3)慢病毒載體法重編程CCD細(xì)胞為iPS細(xì)胞
用攜帶Oct4、Sox2、C-Myc和Klf4基因的慢病毒感染CCD細(xì)胞,24h后種植于飼養(yǎng)層(feeder)細(xì)胞上,并換為hES細(xì)胞培養(yǎng)基,48-72h在倒置熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光,第十天左右開始換為條件培養(yǎng)基。
4)人iPS細(xì)胞建系及其
11、生物學(xué)特性鑒定
a)第7-8天可見CCD細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化,由長(zhǎng)梭形變?yōu)閳A形并聚集；第20天左右挑取克隆；
b)其中只有1株iPS細(xì)胞AP染色呈陽(yáng)性,且具有典型的hES細(xì)胞克隆形態(tài)；
c)1株人iPS細(xì)胞系表達(dá)hES細(xì)胞特有的標(biāo)志性基因；
d)1株人iPS細(xì)胞系表達(dá)hES細(xì)胞特有的標(biāo)志性抗原:SSAE-4(+),TRA-1-60(+),TRA-1-81(+),Oct4(+),SSAE
12、-1(-)；
e)1株人iPS細(xì)胞核型分析未見異常；
f)1株人iPS細(xì)胞系具有體外分化形成囊性擬胚體的能力,并能表達(dá)各胚層的標(biāo)志性基因；
g)畸胎瘤實(shí)驗(yàn)?zāi)壳斑€在進(jìn)行中。
結(jié)論:
1.運(yùn)用Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4四種基因成功將CCD細(xì)胞重編程為iPS細(xì)胞。
2.1株人iPS細(xì)胞系具有人ES細(xì)胞的一些生物學(xué)特,且在體外長(zhǎng)期傳代中能夠維持此特
