IRF-3基因沉默對骨髓樹突狀細胞生物免疫學功能及aGVHD影響的研究.pdf

1、第一部分 IRF-3基因沉默對骨髓樹突狀細胞生物免疫學功能的影響研究
　　 目的：
　　 樹突狀細胞(Dendritic cell，DC)具有激活免疫應答或誘導免疫耐受的功能，未成熟狀態(tài)的樹突狀細胞傾向于誘導免疫耐受產生，被稱為致耐受DC(tolerogenicdendritic cell，Tol DC)。本實驗在成功建立體外擴增高純度小鼠骨髓樹突狀細胞(bone marrow-derived dendritic cel

2、l，BM-DC)方法的基礎上，利用最新的RNA干擾技術(RNA interference，RNAi)針對DC成熟的依賴途徑中關鍵基因IRF-3基因，篩選出最佳的shRNA PCR表達框序列，用于構建IRF-3基因沉默的RNAi-IRF-3-DC，并從細胞形態(tài)、細胞表面分子表達、細胞免疫功能等方面對RNAi-IRF-3-DC的生物免疫學特性進行了比較研究，以期構建出IRF-3基因沉默的全新致耐受DC，RNAi-IRF-3-DC，驗證其誘導

3、T細胞免疫耐受特性及可能機制，為其成功用于治療移植排斥反應及自身免疫性疾病提供可靠的理論和實驗依據(jù)。
　　 方法：
　　 1、小鼠骨髓DC的體外培養(yǎng)與鑒定研究分離C57BL/6小鼠骨髓前體細胞，在重組小鼠粒-巨噬細胞集落刺激因子(rmGM-CSF)和重組白細胞介素-4(rmIL-4)刺激下，貼壁篩選方法，培養(yǎng)擴增骨髓來源DC(BM-DC)，并通過TNF-α刺激誘導DC成熟。實驗分成兩組：①Control-DC組：手法篩選

4、的第8天的DC細胞，即未成熟DC組；②TNF-α-DC組：在培養(yǎng)結束前48h(第6天)加入TNF-α刺激的DC細胞，即成熟DC組。分別從細胞形態(tài)、細胞表面分子表達以及混合淋巴細胞反應(mixed lymphocyte reaction MLR)等方面鑒定體外培養(yǎng)的未成熟DC與成熟DC。
　　 2、樹突狀細胞IRF-3基因沉默及效果檢測研究根據(jù)shRNA設計原則預先設計3段IRF-3 shRNA序列，采用金思特公司PCR表達框試劑

5、盒，構建出相應的3種IRF-3shRNA表達框(R1/shRNA、R2/shRNA、R3/shRNA)，轉染體外培養(yǎng)的成熟DC。實驗分為六組：①Control-DC組；②TNF-α-DC組；③R1/shRNA轉染組：用R1/shRNA轉染成熟DC；R2/shRNA轉染組：用R2/shRNA轉染成熟DC；⑤R3/shRNA轉染組：用R3/shRNA轉染成熟DC；⑥GFP/shRNA轉染組：用GFP/shRNA轉染成熟DC，也即本實驗的陰性

6、對照組)。采用RT-PCR分別在mRNA水平檢測比較各組DC的IRF-3基因表達情況，篩選出IRF-3基因沉默效果最好的有效shRNA序列。
　　 3、IRF-3基因沉默對樹突狀細胞的生物免疫學功能影響研究成功構建shRNA-IRF-3 DC基礎上，實驗分成四組：①Control-DC組；②TNF-α-DC組；③IRF-3基因沉默組(shRNA-IRF-3-DC)：第6天經(jīng)過IRF-3 shRNA處理的培養(yǎng)第8天的DC；④TNF

7、-α刺激的IRF-3基因沉默組(TNF-α-shRNA-IRF-3-DC)第6天經(jīng)過IRF-3 shRNA處理和結束前加入TNF-α(15ng/mL)刺激48h的培養(yǎng)第8天收集的DC。分別從細胞形態(tài)、細胞表面分子表達、混合淋巴細胞反應等方面對shRNA-IRF-3 DC的生物免疫學特性進行了比較研究。
　　 結果：
　　 1、在rmGM-CSF和rmIL-4誘導下，可從小鼠骨髓培養(yǎng)擴增出大量DC。每只小鼠獲得BM-DC約

8、1-2×107個，完全滿足實驗需要。
　　 2、Control-DC組細胞形態(tài)多為圓形、皺褶多、突起較少、細胞器也少。胞內較多吞飲泡，細胞表型檢測MHCⅡ類分子低水平表達，共刺激分子低表達(CD80、CD86)，MLR表明該類DC刺激同種異基因T細胞增殖能力較弱，表現(xiàn)出未成熟DC的特點。TNF-α-DC組細胞經(jīng)TNF-α刺激后，DC胞內囊泡結構減少，線粒體，粗面、滑面內質網(wǎng)等細胞器均顯著增多，表面有大量細長的樹枝狀突起。與Con

9、trol-DC相比，細胞表面共刺激分子呈高水平表達，刺激T細胞增殖能力顯著增強(P<0.001)，呈現(xiàn)成熟DC特征。
　　 3、PCR表達框方法可以得到設計好的針對IRF-3基因3個不同位點的IRF-3shRNA，可用于骨髓未成熟DC的轉染實驗。RT-PCR顯示，與另外兩個位點相比，R2/shRNA可以明顯抑制細胞IRF-3基因表達(P<0.001)。
　　 4、shRNA-IRF-3 DC形態(tài)為圓形或橢圓性、胞內有大量

10、囊泡結構、部分囊泡可見吞噬的異物、細胞核多偏向一側、溶酶體和線粒體等細胞器少、表面突起少、形態(tài)較規(guī)則；細胞表達CD86、CD80表面分子較低。
　　 5、shRNA-IRF-3 DC刺激T細胞增殖能力較Control-DC大致相同(P值>0.05)；TNF-α刺激后shRNA-IRF-3-DC刺激T細胞增殖能力未見明顯增高，與TNF-α-DC組DC的MLR能力差異仍有顯著性(P<0.001)。
　　 結論：
　　

11、 1、小鼠骨髓前體細胞在rmGM-CSF和rmIL-4誘導下，可擴增到大量的DC。
　　 2、手法篩選可以得到85％以上純度的DC，適合應用于DC的分子免疫學研究。
　　 3、R2/shRNA PCR表達框轉染DC可以在mRNA和蛋白質水平明顯抑制細胞IRF-3基因表達，不影響細胞活力和形態(tài)，是最佳的候選shRNA靶位點，適合用于構建shRNA-IRF-3 DC。
　　 4、shRNA-IRF-3-DC在細胞形態(tài)