miR-144對樹突狀細胞免疫學(xué)功能的影響及作用機制研究.pdf

1、樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)是體內(nèi)功能最強的抗原遞呈細胞，參與機體內(nèi)抗原加工處理及遞呈，進而激發(fā)T和B淋巴細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，同時可以分泌多種細胞因子，是連接固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的橋梁，在啟動特異性免疫應(yīng)答及誘導(dǎo)、維持免疫耐受方面具有重要作用。移植免疫學(xué)研究證實，DCs既可以分泌促炎性細胞因子如TNF-α、IL-6、IL-1促進自身活化提升遞呈抗原能力，又可以通過促炎性因子刺激T細胞分化和增殖，啟動免疫應(yīng)答反

2、應(yīng)。另一方面，越來越多的研究者發(fā)現(xiàn)體內(nèi)存在一種負向調(diào)控的DC亞群—耐受型DCs，包括未成熟DCs，它可以分泌抗炎性細胞因子IL-10或抑制性分子ILT-2、ILT-4、HLA-G等負向調(diào)控T細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答反應(yīng)，誘導(dǎo)并維持免疫耐受的產(chǎn)生。通過干預(yù)DCs的功能來調(diào)控機體內(nèi)免疫狀態(tài)，對移植排斥反應(yīng)、自身免疫性疾病、腫瘤的防治具有重要的現(xiàn)實意義?；贒Cs在移植免疫中的特殊地位，對DCs成熟分化過程中重要調(diào)節(jié)分子的研究有助于探索移植免疫排斥

3、、自身免疫性疾病、腫瘤的發(fā)生中的免疫應(yīng)答產(chǎn)生及調(diào)控機制。
　　miRNAs是一類高度保守、廣泛表達于細胞內(nèi)的非編碼小分子RNA，約22～24nt，可通過結(jié)合目的基因的3'非翻譯區(qū)抑制其翻譯從而發(fā)揮免疫調(diào)控作用。近年來，miRNAs對機體免疫系統(tǒng)的調(diào)控作用研究已受到眾多研究者的廣泛關(guān)注。在免疫細胞的研究中發(fā)現(xiàn)，miRNAs在T、B淋巴細胞的活化、增殖中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。但是，miR-144對DCs分化的研究尚未見報道。本研究中，

4、我們分析實驗室前期工作中已有的關(guān)于DCs成熟過程中miRNAs差異性表達的芯片數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)miR-144在成熟后的DCs中出現(xiàn)顯著下調(diào)，提示在DCs成熟過程中miR-144可能是一個重要的負性調(diào)控因子。因此，本論文研究目的是為了探討miR-144對DCs免疫學(xué)功能的影響及其具體作用機制，為移植排斥的防治提出新的途徑和策略，為miRNAs在移植排斥反應(yīng)防治上提供了理論基礎(chǔ)及應(yīng)用的可能性。研究共分三個部分:(1)miR-144在樹突狀細胞成熟

5、前后的差異性表達;(2) miR-144對樹突狀細胞分泌細胞因子的影響及機制研究;(3) miR-144在樹突狀細胞介導(dǎo)Th17免疫反應(yīng)中的作用研究。
　　一、miR-144在樹突狀細胞成熟前后的差異性表達目的:應(yīng)用R語言軟件包分析DCs成熟過程中miR-144差異性表達的miRNAs芯片數(shù)據(jù)并進行驗證。方法:從C57BL/6小鼠四肢骨分離的骨髓細胞細胞懸浮于含10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液中。調(diào)整細胞濃度為2.5×109

6、/L接種于1％明膠包被的6孔板內(nèi)并加入10ng/ml GM-CSF及10ng/ml IL-4，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48小時后小心吸去懸浮細胞及培養(yǎng)液（去除粒細胞），保留貼壁細胞;繼續(xù)培養(yǎng)至第5天半量換液，至第七天吹打收集細胞。工作濃度1000ng/ml的LPS刺激后，8小時收集細胞。培養(yǎng)的細胞于倒置顯微鏡下進行一般形態(tài)學(xué)觀察。應(yīng)用軟件包分析實驗室已有的關(guān)于miRNAs在DCs成熟過程中差異表達的microRNAs芯片檢測數(shù)據(jù)。收集L

7、PS刺激誘導(dǎo)的DCs與未刺激的DCs，抽提細胞總RNA。通過RT-PCR技術(shù)檢測DCs成熟前后miR-144表達量的變化，對比microRNAs芯片數(shù)據(jù)進行驗證。結(jié)果:從microRNAs芯片檢測數(shù)據(jù)中篩選出DCs成熟分化過程中miR-144出現(xiàn)差異性表達，通過RT-PCR進一步檢測表明miR-144在小鼠成熟后的DCs中出現(xiàn)顯著性下調(diào)(P＜0.01)。結(jié)論:miR-144在樹突狀細胞成熟前后呈差異性表達。
　　二、miR-144

8、對樹突狀細胞分泌細胞因子的影響及機制研究目的:探討miR-144在DCs分泌細胞因子中的影響及其作用機制。方法:將miR-144 inhibitors和mimics轉(zhuǎn)染至DCs，轉(zhuǎn)染48小時后收集細胞，用1000ng/ml的LPS刺激成熟。通過RT-PCR檢測LPS刺激成熟后的DCs分泌TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-23表達量的變化，ELISA檢測RANKL蛋白定量表達水平。Western blot檢測LPS刺激成熟后的DCs

9、過程相關(guān)的信號通路活化情況。根據(jù)生物學(xué)信息相關(guān)軟件和數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-144可能存在的潛在作用靶點，并通過熒光素酶報告檢測驗證miR-144與RANKL之間存在靶向關(guān)系。構(gòu)建siRANKL和穩(wěn)定過表達RANKL的DC2.4細胞系，進一步驗證miR-144可以通過靶向作用調(diào)控DCs分泌細胞因子。結(jié)果:轉(zhuǎn)染miR-144 inhibitor可顯著上調(diào)TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-23表達，轉(zhuǎn)染miR-144 mimics可顯著下調(diào)

10、上述細胞因子表達。且高表達miR-144可以抑制p65活化。通過KEGG及TargetScan軟件在TLR4/NF-κB信號通路中miR-144有一個靶基因NF-κB受體活化因子配體(RANKL)，存在兩個保守的結(jié)合位點。熒光素酶報告研究顯示:miR-144 inhibitor可以上調(diào)熒光素酶活性，而miR-144 mimics則下調(diào)熒光素酶活性。應(yīng)用點突變證實miR-144的結(jié)合位點為RANKL3'非翻譯區(qū)679-685處，調(diào)控作用是

11、通過抑制其mRNA翻譯來實現(xiàn)的。miR-144可以通過靶向RANKL影響DCs產(chǎn)生細胞因子。結(jié)論:miR-144可以通過靶向RANKL影響DCs的免疫學(xué)功能。
　　三、miR-144在樹突狀細胞介導(dǎo)Th17免疫反應(yīng)中的作用研究目的:建立穩(wěn)定的CD4+T細胞與DCs共培養(yǎng)誘導(dǎo)Th17細胞的細胞培養(yǎng)體系，探討miR-144在DCs誘導(dǎo)Th17分化及分泌細胞因子中的作用。方法:將從C57BL/6小鼠脾細胞分選的CD4+T細胞與轉(zhuǎn)染miR

12、-144 inhibitors、miR-144 mimics的DCs共培養(yǎng)，并在細胞混懸液中加入適量的游離抗CD3、TGF-β1、IL-6、IL-1β、抗IL-2、抗IFN-γ、抗IL-4、IL-23誘導(dǎo)CD4+T細胞向Th17細胞分化。于5％ CO2孵箱中培養(yǎng)4天后，加入PMA、Ionomycin、BrefeldinA繼續(xù)刺激5-12小時，即可獲得Th17細胞。通過流式細胞技術(shù)檢測共培養(yǎng)體系中誘導(dǎo)的Th17細胞比例，ELISA檢測共培