miR-144對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞免疫學(xué)功能的影響及作用機(jī)制研究.pdf

1、樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)是體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞，參與機(jī)體內(nèi)抗原加工處理及遞呈，進(jìn)而激發(fā)T和B淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，同時(shí)可以分泌多種細(xì)胞因子，是連接固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的橋梁，在啟動(dòng)特異性免疫應(yīng)答及誘導(dǎo)、維持免疫耐受方面具有重要作用。移植免疫學(xué)研究證實(shí)，DCs既可以分泌促炎性細(xì)胞因子如TNF-α、IL-6、IL-1促進(jìn)自身活化提升遞呈抗原能力，又可以通過(guò)促炎性因子刺激T細(xì)胞分化和增殖，啟動(dòng)免疫應(yīng)答反

2、應(yīng)。另一方面，越來(lái)越多的研究者發(fā)現(xiàn)體內(nèi)存在一種負(fù)向調(diào)控的DC亞群—耐受型DCs，包括未成熟DCs，它可以分泌抗炎性細(xì)胞因子IL-10或抑制性分子ILT-2、ILT-4、HLA-G等負(fù)向調(diào)控T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答反應(yīng)，誘導(dǎo)并維持免疫耐受的產(chǎn)生。通過(guò)干預(yù)DCs的功能來(lái)調(diào)控機(jī)體內(nèi)免疫狀態(tài)，對(duì)移植排斥反應(yīng)、自身免疫性疾病、腫瘤的防治具有重要的現(xiàn)實(shí)意義?；贒Cs在移植免疫中的特殊地位，對(duì)DCs成熟分化過(guò)程中重要調(diào)節(jié)分子的研究有助于探索移植免疫排斥

3、、自身免疫性疾病、腫瘤的發(fā)生中的免疫應(yīng)答產(chǎn)生及調(diào)控機(jī)制。
　　miRNAs是一類高度保守、廣泛表達(dá)于細(xì)胞內(nèi)的非編碼小分子RNA，約22～24nt，可通過(guò)結(jié)合目的基因的3'非翻譯區(qū)抑制其翻譯從而發(fā)揮免疫調(diào)控作用。近年來(lái)，miRNAs對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的調(diào)控作用研究已受到眾多研究者的廣泛關(guān)注。在免疫細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，miRNAs在T、B淋巴細(xì)胞的活化、增殖中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。但是，miR-144對(duì)DCs分化的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究中，

4、我們分析實(shí)驗(yàn)室前期工作中已有的關(guān)于DCs成熟過(guò)程中miRNAs差異性表達(dá)的芯片數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)miR-144在成熟后的DCs中出現(xiàn)顯著下調(diào)，提示在DCs成熟過(guò)程中miR-144可能是一個(gè)重要的負(fù)性調(diào)控因子。因此，本論文研究目的是為了探討miR-144對(duì)DCs免疫學(xué)功能的影響及其具體作用機(jī)制，為移植排斥的防治提出新的途徑和策略，為miRNAs在移植排斥反應(yīng)防治上提供了理論基礎(chǔ)及應(yīng)用的可能性。研究共分三個(gè)部分:(1)miR-144在樹(shù)突狀細(xì)胞成熟

5、前后的差異性表達(dá);(2) miR-144對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響及機(jī)制研究;(3) miR-144在樹(shù)突狀細(xì)胞介導(dǎo)Th17免疫反應(yīng)中的作用研究。
　　一、miR-144在樹(shù)突狀細(xì)胞成熟前后的差異性表達(dá)目的:應(yīng)用R語(yǔ)言軟件包分析DCs成熟過(guò)程中miR-144差異性表達(dá)的miRNAs芯片數(shù)據(jù)并進(jìn)行驗(yàn)證。方法:從C57BL/6小鼠四肢骨分離的骨髓細(xì)胞細(xì)胞懸浮于含10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液中。調(diào)整細(xì)胞濃度為2.5×109

6、/L接種于1％明膠包被的6孔板內(nèi)并加入10ng/ml GM-CSF及10ng/ml IL-4，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48小時(shí)后小心吸去懸浮細(xì)胞及培養(yǎng)液（去除粒細(xì)胞），保留貼壁細(xì)胞;繼續(xù)培養(yǎng)至第5天半量換液，至第七天吹打收集細(xì)胞。工作濃度1000ng/ml的LPS刺激后，8小時(shí)收集細(xì)胞。培養(yǎng)的細(xì)胞于倒置顯微鏡下進(jìn)行一般形態(tài)學(xué)觀察。應(yīng)用軟件包分析實(shí)驗(yàn)室已有的關(guān)于miRNAs在DCs成熟過(guò)程中差異表達(dá)的microRNAs芯片檢測(cè)數(shù)據(jù)。收集L

7、PS刺激誘導(dǎo)的DCs與未刺激的DCs，抽提細(xì)胞總RNA。通過(guò)RT-PCR技術(shù)檢測(cè)DCs成熟前后miR-144表達(dá)量的變化，對(duì)比microRNAs芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果:從microRNAs芯片檢測(cè)數(shù)據(jù)中篩選出DCs成熟分化過(guò)程中miR-144出現(xiàn)差異性表達(dá)，通過(guò)RT-PCR進(jìn)一步檢測(cè)表明miR-144在小鼠成熟后的DCs中出現(xiàn)顯著性下調(diào)(P＜0.01)。結(jié)論:miR-144在樹(shù)突狀細(xì)胞成熟前后呈差異性表達(dá)。
　　二、miR-144

8、對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響及機(jī)制研究目的:探討miR-144在DCs分泌細(xì)胞因子中的影響及其作用機(jī)制。方法:將miR-144 inhibitors和mimics轉(zhuǎn)染至DCs，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后收集細(xì)胞，用1000ng/ml的LPS刺激成熟。通過(guò)RT-PCR檢測(cè)LPS刺激成熟后的DCs分泌TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-23表達(dá)量的變化，ELISA檢測(cè)RANKL蛋白定量表達(dá)水平。Western blot檢測(cè)LPS刺激成熟后的DCs

9、過(guò)程相關(guān)的信號(hào)通路活化情況。根據(jù)生物學(xué)信息相關(guān)軟件和數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-144可能存在的潛在作用靶點(diǎn)，并通過(guò)熒光素酶報(bào)告檢測(cè)驗(yàn)證miR-144與RANKL之間存在靶向關(guān)系。構(gòu)建siRANKL和穩(wěn)定過(guò)表達(dá)RANKL的DC2.4細(xì)胞系，進(jìn)一步驗(yàn)證miR-144可以通過(guò)靶向作用調(diào)控DCs分泌細(xì)胞因子。結(jié)果:轉(zhuǎn)染miR-144 inhibitor可顯著上調(diào)TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-23表達(dá)，轉(zhuǎn)染miR-144 mimics可顯著下調(diào)

10、上述細(xì)胞因子表達(dá)。且高表達(dá)miR-144可以抑制p65活化。通過(guò)KEGG及TargetScan軟件在TLR4/NF-κB信號(hào)通路中miR-144有一個(gè)靶基因NF-κB受體活化因子配體(RANKL)，存在兩個(gè)保守的結(jié)合位點(diǎn)。熒光素酶報(bào)告研究顯示:miR-144 inhibitor可以上調(diào)熒光素酶活性，而miR-144 mimics則下調(diào)熒光素酶活性。應(yīng)用點(diǎn)突變證實(shí)miR-144的結(jié)合位點(diǎn)為RANKL3'非翻譯區(qū)679-685處，調(diào)控作用是

11、通過(guò)抑制其mRNA翻譯來(lái)實(shí)現(xiàn)的。miR-144可以通過(guò)靶向RANKL影響DCs產(chǎn)生細(xì)胞因子。結(jié)論:miR-144可以通過(guò)靶向RANKL影響DCs的免疫學(xué)功能。
　　三、miR-144在樹(shù)突狀細(xì)胞介導(dǎo)Th17免疫反應(yīng)中的作用研究目的:建立穩(wěn)定的CD4+T細(xì)胞與DCs共培養(yǎng)誘導(dǎo)Th17細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)體系，探討miR-144在DCs誘導(dǎo)Th17分化及分泌細(xì)胞因子中的作用。方法:將從C57BL/6小鼠脾細(xì)胞分選的CD4+T細(xì)胞與轉(zhuǎn)染miR

12、-144 inhibitors、miR-144 mimics的DCs共培養(yǎng)，并在細(xì)胞混懸液中加入適量的游離抗CD3、TGF-β1、IL-6、IL-1β、抗IL-2、抗IFN-γ、抗IL-4、IL-23誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化。于5％ CO2孵箱中培養(yǎng)4天后，加入PMA、Ionomycin、BrefeldinA繼續(xù)刺激5-12小時(shí)，即可獲得Th17細(xì)胞。通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)共培養(yǎng)體系中誘導(dǎo)的Th17細(xì)胞比例，ELISA檢測(cè)共培