中藥虎杖抗原、抗體制備及其特異性檢測.pdf

1、目的：利用免疫學的方法制備中藥虎杖各成分的抗原、抗體并進行特異性檢測。
　　 方法：首先分別制備虎杖的全成分抗原，然后分別應用琥珀酸酐法、重氮化對氨基苯甲酸法以及改良的重氮化對氨基苯甲酸法將標準品大黃素與小牛血清白蛋白（BSA）連接，用以上各抗原免疫昆明小鼠，制備抗血清。
　　 結果：⑴用紫外分光光度計掃描大黃素、BSA、PBS、大黃素-BSA1、大黃素-BSA2和大黃素-BSA3。⑵用醋酸纖維濾紙雙向免疫擴散法，取虎杖

2、水提液（含所有虎杖成分抗原）1：10作抗原，與各組抗血清反應，檢測抗血清效價，判定各組抗原的免疫原性。在虎杖粗提抗原各組中，虎杖水提醇沉物組抗血清的抗體效價最高為1：16，即免疫原性最強；其次虎杖水提液組為1：4，免疫原性較弱；虎杖水提醇沉上清組為1：2，免疫原性相對最弱。在純提大黃素抗原各組中，抗體效價依次為大黃素-BSA3組為1：8、大黃素-BSA2組為1：4、大黃素-BSA1組為1：2。因此，可以判定大黃素-BSA3組免疫原性最強

3、，大黃素-BSA1組免疫原性相對較弱；單純大黃素沒有免疫原性。⑶選擇大黃素不同基團與BSA連接，必然影響半抗原的表達結構，產生不同的抗原表位，免疫動物必然影響其免疫原性和抗體的特異性。采用Western印跡改良法檢測大黃素-BSA不同連接法免疫動物產生抗體對相似結構大黃素、大黃酸、大黃素甲醚、大黃酚特異性或交叉反應的反應性。用琥珀酸酐法連接的大黃素-BSA1組產生的抗大黃素抗體，除了與大黃素結合外，也能與大黃素甲醚、大黃酚發(fā)生交叉反應；

4、而用重氮化對氨基苯甲酸法連接的大黃素-BSA2組產生的抗大黃素抗體，僅與大黃素特異性結合，不與大黃素甲醚、大黃酚發(fā)生交叉反應；用改良的重氮化對氨基苯甲酸法連接的大黃素-BSA3組產生的抗大黃素抗體，與大黃素高度結合，與大黃素甲醚、大黃酚發(fā)生可疑性交叉反應。但三者均不與大黃酸發(fā)生交叉反應。⑷中藥大分子成分（如中藥蛋白、多糖等），可直接刺激動物產生抗體，但在理論上講，小分子半抗原成分不能直接刺激動物產生抗體。實驗發(fā)現(xiàn)：虎杖粗提液（包括虎杖水

5、提液、虎杖水提醇沉物、虎杖水提醇沉上清）免疫小鼠，均產生了不同程度的抗大黃素抗體、抗大黃酸抗體、抗大黃素甲醚抗體和抗大黃酚抗體。其中以虎杖水提醇沉物組產生的抗體最全面和效價最高。但直接用純化的大黃素免疫，不產生抗體。⑸分別用虎杖粗提液和與其遺傳上相差甚遠、不含有相同成分的白花蛇草水提液免疫小鼠，制備抗血清。通過醋酸纖維濾紙雙向免疫擴散法檢測其抗體特異性，結果見表5。各組抗虎杖粗提液抗血清只與虎杖水提液發(fā)生反應，與大黃水提液發(fā)生輕度交叉反

6、應，但均不與白花蛇草水提液發(fā)生反應；白花蛇草水提液抗血清只與白花蛇草發(fā)生反應，均不與虎杖水提液發(fā)生反應。
　　 結論：①琥珀酸酐法連接的大黃素-BSA復合物，免疫小鼠產生的抗體，不僅與大黃素結合，也能與大黃素甲醚、大黃酚交叉結合。②同一種連接方法，連接到載體的半抗原的量（即結合比），在一定范圍內，結合比越高，半抗原的免疫原性就越大。影響其免疫原性除了與其結合比有關外，更與其連接方法有關，這可能與不同連接法對大黃素的抗原表位結構的

7、免疫原性和大黃素.BSA復合物形成的半抗原的抗原表位種類和數(shù)量有關。③虎杖粗提液免疫小鼠制備的抗血清，能與虎杖水提液發(fā)生抗原抗體反應，不與無關的白花蛇草水提液發(fā)生反應。證實其抗體具有種屬特異性。它能與同屬科大黃水提液發(fā)生輕度的交叉反應，這與同一科屬的虎杖和大黃在遺傳上具有一定的同源性，含有同源性蛋白和共同小分子成分有關。④用虎杖粗提液免疫小鼠，可產生不同程度的抗小分子成分抗體（如抗大黃素抗體、抗大黃酸抗體、抗大黃素甲醚抗體和抗大黃酚抗體