脂肪細胞特異性核酸適配體的篩選、分子識別及應用初探.pdf

1、第一部分建立針對3T3-L1脂肪細胞的指數(shù)級富集的配體系統(tǒng)進化技術
　　目的：本研究建立3T3-L1脂肪細胞分化模型,采用細胞的指數(shù)級富集的配體系統(tǒng)進化技術(Systematic Evolution of Ligands byExponential Enrichment,cell-SELEX)針對分化成熟的3T3-L1脂肪細胞進行文庫篩選,并獲得能識別脂肪細胞表面膜結構的核酸適配體(Aptamer)。
　　方法：設計并合成隨

2、機序列DNA文庫,分別用異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)及生物素biotin標記引物。將3T3-L1前脂肪細胞通過雞尾酒方法誘導脂肪細胞分化,選用分化成熟的3T3-L1細胞作為正篩選細胞,而未分化的前體3T3-L1及HepG2作為負細胞,將文庫與正負細胞反復孵育進行篩選,與正細胞結合文庫采用聚合酶鏈法擴增并用作下輪篩選及鑒定。使用流式細胞技術對文庫的富集程度進行監(jiān)測,鑒定。采用454測序方

3、法對富集文庫進行測序,合成相關序列并通過流式細胞術進行鑒定。
　　結果：使用傳統(tǒng)的雞尾酒方法成功建立了脂肪細胞分化模型,通過應用cell-SELEX對分化成熟的脂肪細胞展開篩選,經過19輪正負篩選成功富集到針對分化成熟3T3-L1脂肪細胞的ssDNA文庫,經過測序分析發(fā)現(xiàn)了4條核酸適體與該脂肪細胞有結合,分別命名為Adipo-2,Adipo-4,Adipo-5及Adipo-8.
　　結論：通過CELL-SELEX技術針對脂肪

4、細胞進行篩選,可以獲得與靶細胞高親和性的核酸適配體。
　　第二部分脂肪細胞相關棱酸適配體及其功能研究
　　目的：在第一部分實驗的基礎上對篩選出針對脂肪細胞表面的核酸適配體進行特異性分析、解離常數(shù)測定及不同條件對其結合性能的影響,以進一步了解所篩選的核酸適配體的結合特性。
　　方法：合成篩選的核酸適配體,與不同系統(tǒng)來源的細胞進行結合試驗,采用流式細胞術對其結合性能進行鑒定;將核酸適體稀釋成不同濃度后與分化成熟3T3-L1

5、脂肪細胞進行孵育,使用流式細胞儀檢測不同濃度核酸適體的結合能力,并計算各核酸適體的解離常數(shù);采用流式細胞術檢測了核酸適體在不同溫度孵育,胰島素刺激靶細胞及核酸適體不同截短方案對其結合性能影響。
　　結果：核酸適體Adipo1和Adipo8均能與脂肪細胞結合,而對其它系統(tǒng)來源的細胞幾乎沒有結合性能。解離常數(shù)測定提示Adipo8,Adipo-1能與脂肪細胞高親和力、高特異性結合,所測Kd值分別為17.5±5.1 nM和97.5±13.

6、5 nM。4℃和37℃孵育條件對所測核酸適體的結合沒有影響。Adipo8與分化成熟脂肪的3T3-L1脂肪細胞的結合能被trpsin及。Protienase K消化液消化,而Adipo1則不受影響。經過500nM胰島素處理對Adipo1和Adipo8與分化成熟的脂肪細胞的結合幾乎沒有影響。
　　結論：核酸適配體Adipo8對分化成熟的脂肪細胞顯示出良好的結合性及高度特異性,Adipo8可能的靶標為脂肪細胞表面某種與胰島素作用不相關的

7、膜蛋白,但具體機制有待進一步研究。
　　第三部分脂肪細胞核酸適配體的特異性分子識別及應用初探
　　目的：前述細胞實驗表明,核酸適體Adipo8在體外顯示出針對3T3-L1脂肪細胞的結合特異性,本部分實驗通過大鼠冰凍組織切片進一步證實其特異性,探討使用該核酸適配體用于監(jiān)測脂肪細胞分化程度,流式分選分化成熟脂肪細胞及體內應用。
　　方法：雄性SD大鼠頸椎脫位法處死后,取附睪脂肪組織,肝臟骨骼肌及胰腺組織制成石蠟切片或直接冰

8、凍切片。冰凍切片時,取上述新鮮組織用OCT包埋置于-20℃低溫恒溫器迅速冷凍后,切成10μm薄片,貼片后用4℃預冷的丙酮室溫下固定15 min,用PBS洗后采用H&E染色及疫光核酸適配體染色。染色切片置于熒光顯微鏡下觀察,比較兩種方法處理組織時核酸適體對其結合情況;通過流式細胞術檢測核酸適配體及對照文庫對不同分化階段的脂肪細胞的結合程度,探討兩者相對熒光強度與分化時間的相關性,采用流式細胞儀對與核酸適配體結合部分的脂肪細胞進行分選;將核

9、酸適配體用cy5標記后將其經尾靜脈注射入SD大老鼠,生理鹽水灌注后取不同組織進行熒光檢測以確定核酸適體的靶向性。
　　結果：核酸適配體Adipo-8與S-D大鼠冰凍附睪脂肪組織切片孵育后顯示出很強的熒光信號,而冰凍肝臟,骨骼肌,胰腺組織與核酸適配體孵育后無熒光信號。對照核酸適體文庫與大鼠冰凍附睪脂肪組織孵育未觀察到熒光信號。核酸適體Adipo-8與對照文庫的相對熒光強度與脂肪細胞分化時間呈正相關。Adipo-8經尾靜脈注射到活體大