叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子Foxp3重組腺病毒的構(gòu)建及鑒定.pdf

1、Foxp3是叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子(Forkheadtranscriptionfactor)P亞家族的新成員。目前研究證實(shí)該基因特異性表達(dá)于固有CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，并在該細(xì)胞的發(fā)育和功能維持中起重要作用，是CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞特異性標(biāo)志物之一，并作為轉(zhuǎn)錄抑制因子參與免疫應(yīng)答的調(diào)控。Foxp3包含叉頭狀結(jié)構(gòu)域、C2H2鋅指結(jié)構(gòu)及亮氨酸拉鏈等保守序列，在與靶基因啟動(dòng)子和某些蛋白質(zhì)結(jié)合上起著重要作用。 近年來(lái)，人們通過(guò)構(gòu)

2、建Foxp3重組逆轉(zhuǎn)錄病毒、Foxp3轉(zhuǎn)基因模型等方法對(duì)該基因的作用機(jī)制及臨床應(yīng)用展開(kāi)了廣泛的研究。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Foxp3的異位表達(dá)在體外可誘導(dǎo)與固有CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表型及作用相似的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的產(chǎn)生；誘導(dǎo)產(chǎn)生的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在體內(nèi)可直接或間接抑制效應(yīng)性T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞及某些抗原提呈細(xì)胞(如樹(shù)突狀細(xì)胞)等的增殖、分化和免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)體內(nèi)免疫耐受的產(chǎn)生，對(duì)治療某些自身免疫病及移植排斥反應(yīng)有一定效果；隨著研究的深入，該基因在腫

3、瘤免疫的作用也越來(lái)越受到關(guān)注，有文獻(xiàn)報(bào)道在某些腫瘤組織及周?chē)馨徒Y(jié)等處發(fā)現(xiàn)Foxp3的表達(dá)，為腫瘤逃逸機(jī)制的研究以及新型靶向制劑的開(kāi)發(fā)提供了新思路。 為更深入研究Foxp3的作用機(jī)制及誘導(dǎo)免疫耐受方面的應(yīng)用，本實(shí)驗(yàn)利用AdEasyTMXL系統(tǒng)構(gòu)建攜帶Foxp3的重組腺病毒，并行初步鑒定。方法：從小鼠胸腺組織獲取約1.3kb大小的目的基因，克隆至穿梭載體pShuttle-IRES-hrGFP-1構(gòu)建重組穿梭載體；PmeⅠ線性化重組

4、穿梭質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化BJ5183-AD-1感受態(tài)細(xì)菌，以細(xì)菌內(nèi)同源重組方式完成腺病毒骨架與穿梭質(zhì)粒的同源重組，構(gòu)建攜帶Foxp3的重組腺病毒質(zhì)粒；經(jīng)人胚胎腎細(xì)胞(AD293)包裝后產(chǎn)生復(fù)制缺陷的重組腺病毒Ad-Foxp3。提取感染重組腺病毒的AD293細(xì)胞總RNA及總蛋白，以RT-PCR及WesternBlot檢測(cè)Foxp3mRNA和蛋白的表達(dá)。病毒擴(kuò)增三代后，用半數(shù)組織培養(yǎng)感染量(tissuecultureinfectiousdose50，

5、TCID50)方法測(cè)定重組腺病毒的滴度。最后，用HeLa細(xì)胞對(duì)野生型腺病毒進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果：重組腺病毒Ad-Foxp3轉(zhuǎn)染AD293細(xì)胞3天后可觀察到綠色熒光蛋白(hrGFP)的表達(dá)，6～7天后，大部分細(xì)胞出現(xiàn)腫脹、脫落等細(xì)胞致病變效應(yīng)(CPE)；RT-PCR檢測(cè)表明Foxp3在AD293細(xì)胞可正確轉(zhuǎn)錄；WesternBlot檢測(cè)顯示Foxp3表達(dá)蛋白可與小鼠Foxp3IgG單克隆抗體特異性結(jié)合，而且分子量大小與預(yù)期一致；擴(kuò)增三代后，病毒