人纖溶酶原K5重組腺病毒的構(gòu)建及其功能研究.pdf

1、血管增生(neovascularization)與腫瘤的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移、血管增生性眼病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等重大疾病密切相關(guān)。目前治療血管增生性疾病著眼于血管增生平衡調(diào)空的兩個(gè)方面：要么應(yīng)用血管增生抑制劑，要么采用血管增生刺激因子的拮抗劑，以恢復(fù)病理狀態(tài)下被打破的血管增生調(diào)空的平衡。近年來(lái)，人纖溶酶原(plasminogen)的水解片段kringle5因其獨(dú)特的性質(zhì)引起了科學(xué)界的重視。 K5是人纖溶酶原中第五個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)域，能特異性的抑制內(nèi)

2、皮細(xì)胞生長(zhǎng)，是最強(qiáng)的血管增生抑制因子之一。本實(shí)驗(yàn)室在以前的研究中，利用原核表達(dá)體系獲得K5和K5突變體重組蛋白，并觀察它們對(duì)糖尿病性視網(wǎng)膜病和腫瘤的作用。研究顯示K5具有分子量小，性質(zhì)穩(wěn)定，能有效的抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移以及增殖，對(duì)于糖尿病性視網(wǎng)膜血管增生和腫瘤的生長(zhǎng)具有較強(qiáng)的抑制作用。 由于原核表達(dá)基因工程重組蛋白具有毒性無(wú)法去除，在體內(nèi)易降解，需反復(fù)注射等無(wú)法克服的缺點(diǎn)，且不利于用于進(jìn)行內(nèi)源性：K5的作用機(jī)制的探討。因此，本

3、研究在原有的工作基礎(chǔ)上，希望通過(guò)基因治療的途徑來(lái)改善上述問(wèn)題。鑒于缺陷性腺病毒載體具有安全、高效、簡(jiǎn)單易行等優(yōu)點(diǎn)，我們選擇了Adeasy-1系統(tǒng)來(lái)作為K5基因治療的載體。Adeasy-1是缺陷性腺病毒的骨架質(zhì)粒，通過(guò)其穿梭質(zhì)粒Adtrack-CMV將外源性基因與病毒骨架整合，從而包裝出具有廣泛感染性的重組腺病毒。本研究構(gòu)建攜帶．K5基因(含和不含真核信號(hào)肽)的重組腺病毒，鑒定腺病毒感染力和目的基因表達(dá)情況，并進(jìn)行基本的細(xì)胞內(nèi)功能研究，為

4、進(jìn)一步研究攜帶K5的腺病毒體內(nèi)抑制血管增生的效果和機(jī)制奠定基礎(chǔ)。 第一部分 K5病毒骨架的構(gòu)建方法： 1．根據(jù)K5的序列設(shè)計(jì)特異性引物，將其重組進(jìn)入pDisplay質(zhì)粒用以獲取pDisplay質(zhì)粒中的真核信號(hào)肽序列； 2．測(cè)序鑒定重組質(zhì)粒； 3．根據(jù)K5的序列設(shè)計(jì)特異性引物，分別克隆出不帶信號(hào)肽的K5與攜帶信號(hào)肽的spK5基因片段(真核信號(hào)肽序列來(lái)源于pDisplay質(zhì)粒)，將其重組進(jìn)入腺病毒穿梭質(zhì)粒構(gòu)建

5、重組體； 4．測(cè)序鑒定重組質(zhì)粒； 5．將穿梭質(zhì)粒與Adeasy-1質(zhì)粒Pme-I線性化后在大腸桿菌BJ5183中同源重組： 6．將上述同源重組質(zhì)粒Pac-I線性化后獲得三種病毒骨架Ad-K5、Ad-spK5與Ad-control，純化滅菌； 7．酶切和PCR鑒定病毒骨架。 結(jié)果： 1．DNA序列分析顯示穿梭質(zhì)粒構(gòu)建正確； 2．酶切鑒定證明同源重組成功，PCR鑒定證明病毒骨架中攜帶有

6、目的基因。 第二部分重組腺病毒的包裝純化與功能實(shí)驗(yàn)方法： 1．脂質(zhì)體包裹法將上述三種純化滅菌的病毒骨架DNA導(dǎo)入293A細(xì)胞中，包裝病毒； 2．觀察GFP的表達(dá)情況； 3．8-10日左右凍融法裂解細(xì)胞，獲取原代病毒液； 4．用原代病毒液感染293細(xì)胞，大量擴(kuò)增病毒； 5．CsCl梯度離心純化病毒液； 6．感染Hela細(xì)胞、肝細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞等觀察病毒感染能力； 7．Weste

7、rn-blot檢測(cè)病毒攜帶的K5基因表達(dá)情況； 8．MTT法檢測(cè)重組病毒對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響。 結(jié)果： 1．綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)顯示病毒包裝良好； 2．純化后病毒具有很高的感染細(xì)胞的能力； 3．western-blot結(jié)果顯示攜帶K5基因的腺病毒可在宿主細(xì)胞中表達(dá)K5和spK5蛋白。 4．MTT結(jié)果顯示含與不含信號(hào)肽的K5重組腺病毒均有抑制血管增生的作用。 結(jié)論

8、 1．成功構(gòu)建了Ad-K5、Ad-spK5以及Ad-control三個(gè)重組腺病毒骨架質(zhì)粒； 2．成功包裝出了rAd-K5、rAd-spK5以及rAd-control三個(gè)重組腺病毒； 3．純化后的三種病毒對(duì)人正常肝細(xì)胞、Hela細(xì)胞、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞中都具有很高的感染力； 4．重組腺病毒在細(xì)胞中成功表達(dá)出目的蛋白，顯示重組腺病毒具有表達(dá)目的蛋白的活性； 5．MTT結(jié)果顯示含與不含真核信號(hào)肽的重組