豬瘟病毒主要抗原基因與豬IL2重組腺病毒的構建及鑒定.pdf

1、本研究將豬瘟病毒主要抗原基因、非結構蛋白基因和豬源細胞因子插入腺病毒表達載體系統(tǒng)中，構建成多組重組腺病毒，為豬瘟病毒活載體疫苗的研究奠定基礎。 以豬瘟病毒石門毒(F119代)和豬外周血淋巴細胞為材料，根據GeneBank數據庫中已發(fā)表基因序列設計特異性引物，采用RT-PCR方法將完整豬瘟病毒主要抗原基因E0、E2和非結構蛋白基因NS2．3以及豬源細胞因子IL2依次克隆入plRES載體MCSA和MCSB中，經酶切、PCR及測序鑒定

2、，獲得可用于構建腺病毒載體的單基因、雙基因和三基因pIRES質粒。將重組plRES質粒中目的基因片段亞克隆入腺病毒穿梭質粒pShutfie-CMV(pSC)中，構建了多組重組腺病毒穿梭質粒， 將含有豬瘟病毒E2基因的穿梭質粒電轉入含有腺病毒骨架質粒pAdEasy-1的大腸桿菌R15183中進行細菌內同源重組，得到6種重組腺病毒質粒：pAd-E2、pAd-IL2、pAd-E21L2、pAd-E2E2、pAd-E2E2IL2和pAd

3、-C。應用脂質體轉染技術將線性化的陽性重組腺病毒質粒轉導入293A細胞中得到重組腺病毒：tAd-E2、rAd-IL2、rAd-E2E2、rAd-E21L2和rAd-E2E2IL2和rAd-C。接種該6株重組腺病毒的293A細胞于37~CC02培養(yǎng)箱培養(yǎng)7～10天，細胞產生圓縮、聚簇成葡萄狀、脫落等細胞病變；RT-PCR鑒定結果表明外源基因E2和IL2均正確插入，且隨腺病毒基因組一起進行轉錄；SDS-PAGE和Western-Blot檢測

4、可知外源豬瘟E2蛋白得到正確表達，具有反應原性，豬源IL2定量ELISA試劑盒檢測表明二代重組腺病毒樣品tAd-IL2、rAd-E2IL2、rAd-E2E2IL2的IL2基因均得到正確表達，且濃度分別為148．4、120．4、114．2pg／ml；在293A細胞上連續(xù)傳代3次后再測定組織細胞半數感染量，重組腺病毒效價穩(wěn)定；五種重組腺病毒質粒的滴度(TCIDso／m1)分別為：106.76(rAd-E2)、104-36(rAd-IL2)、