豬瘟病毒主要抗原基因與豬IL2重組腺病毒的構(gòu)建及鑒定.pdf

1、本研究將豬瘟病毒主要抗原基因、非結(jié)構(gòu)蛋白基因和豬源細(xì)胞因子插入腺病毒表達(dá)載體系統(tǒng)中，構(gòu)建成多組重組腺病毒，為豬瘟病毒活載體疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。 以豬瘟病毒石門毒(F119代)和豬外周血淋巴細(xì)胞為材料，根據(jù)GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已發(fā)表基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，采用RT-PCR方法將完整豬瘟病毒主要抗原基因E0、E2和非結(jié)構(gòu)蛋白基因NS2．3以及豬源細(xì)胞因子IL2依次克隆入plRES載體MCSA和MCSB中，經(jīng)酶切、PCR及測(cè)序鑒定

2、，獲得可用于構(gòu)建腺病毒載體的單基因、雙基因和三基因pIRES質(zhì)粒。將重組plRES質(zhì)粒中目的基因片段亞克隆入腺病毒穿梭質(zhì)粒pShutfie-CMV(pSC)中，構(gòu)建了多組重組腺病毒穿梭質(zhì)粒， 將含有豬瘟病毒E2基因的穿梭質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入含有腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1的大腸桿菌R15183中進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)同源重組，得到6種重組腺病毒質(zhì)粒：pAd-E2、pAd-IL2、pAd-E21L2、pAd-E2E2、pAd-E2E2IL2和pAd

3、-C。應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將線性化的陽性重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)入293A細(xì)胞中得到重組腺病毒：tAd-E2、rAd-IL2、rAd-E2E2、rAd-E21L2和rAd-E2E2IL2和rAd-C。接種該6株重組腺病毒的293A細(xì)胞于37~CC02培養(yǎng)箱培養(yǎng)7～10天，細(xì)胞產(chǎn)生圓縮、聚簇成葡萄狀、脫落等細(xì)胞病變；RT-PCR鑒定結(jié)果表明外源基因E2和IL2均正確插入，且隨腺病毒基因組一起進(jìn)行轉(zhuǎn)錄；SDS-PAGE和Western-Blot檢測(cè)

4、可知外源豬瘟E2蛋白得到正確表達(dá)，具有反應(yīng)原性，豬源IL2定量ELISA試劑盒檢測(cè)表明二代重組腺病毒樣品tAd-IL2、rAd-E2IL2、rAd-E2E2IL2的IL2基因均得到正確表達(dá)，且濃度分別為148．4、120．4、114．2pg／ml；在293A細(xì)胞上連續(xù)傳代3次后再測(cè)定組織細(xì)胞半數(shù)感染量，重組腺病毒效價(jià)穩(wěn)定；五種重組腺病毒質(zhì)粒的滴度(TCIDso／m1)分別為：106.76(rAd-E2)、104-36(rAd-IL2)、