攜帶小鼠Brcc3基因重組腺病毒的包裝及鑒定.pdf

1、目的:構(gòu)建能夠在體外真核細(xì)胞中過表達(dá)目標(biāo)基因Brcc3的重組腺病毒真核表達(dá)載體，并進(jìn)而使用HEK293細(xì)胞包裝重組腺病毒，從而為后續(xù)轉(zhuǎn)染小鼠心臟成纖維細(xì)胞（cFs）探討細(xì)胞內(nèi)Brcc3基因過表達(dá)對(duì)TGF-β信號(hào)通路各環(huán)節(jié)的影響做準(zhǔn)備。
　　方法:
　　1、目的基因片段的擴(kuò)增（擴(kuò)增包括雙酶切位點(diǎn)的目標(biāo)基因序列）
　　分別以Ndel-Sacl-Brcc3-F和Brcc3-R為上下游引物擴(kuò)增Sacl-Brcc3;以Brcc3

2、-GST-F和Xhol-Spel-GST-R擴(kuò)增 GST-Xhol及以 Ndel-Sacl-Brcc3-F和Xhol-Spel-GST-R擴(kuò)增Sacl-Brcc3-GST-Xhol。
　　2、利用酶切連接構(gòu)建pDown-Brcc3/GST/IRES/EGFP并測(cè)序鑒定Sacl/Xhol雙酶切骨架載體pDown-MCS-IRES/EGFP和PCR回收產(chǎn)物Sacl-Brcc3-GST-Xhol，并將骨架片段pDown-MCS-IRES

3、/EGFP和目的基因Brcc3-GST連接，接著轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物到感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌stbl3，進(jìn)行菌落PCR鑒定后挑取單克隆搖菌提取質(zhì)粒pDown-Brcc3/GST/IRES/EGFP送測(cè)序。
　　3、利用Gateway Technology構(gòu)建pAV.Ex1d-CMV＞Brcc3/GST/IRES/EGFPpDown-Brcc3/GST/IRES/EGFP和pAV.Des1d進(jìn)行LR反應(yīng)，將目標(biāo)基因克隆到腺病毒載體pAV.Des

4、1d，于（反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到）大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞stbl3中進(jìn)行（復(fù)制），PCR鑒定陽性克隆，挑單克隆搖菌提取質(zhì)粒送檢測(cè)序。
　　4、將重組腺病毒轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞，進(jìn)行病毒的包裝和擴(kuò)增，并提取轉(zhuǎn)染的CFs細(xì)胞蛋白行Western blot檢測(cè)Brcc36蛋白表達(dá)水平。
　　主要結(jié)果:
　　1、經(jīng)瓊脂糖電泳鑒定表明目的片段Sacl-Brcc3-GST-Xhol擴(kuò)增成功。
　　2、經(jīng)PCR檢測(cè)、瓊脂糖電泳及基因測(cè)序表明載

5、體pDown-Brcc3/GST/IRES/EGFP構(gòu)建成功。
　　3、經(jīng)PCR檢測(cè)、瓊脂糖電泳、基因測(cè)序及western blot分析表明重組腺病毒真核表達(dá)載體pAV.Exld-CMV＞Brcc3/GST/IRES/EGFP構(gòu)建成功。
　　主要結(jié)論:本研究利用Gateway技術(shù)成功構(gòu)建重組腺病毒真核表達(dá)載體pAV.Exld-CMV＞Brcc3/GST/IRES/EGFP，并成功包裝獲得過表達(dá)Brcc3基因的腺病毒。