人MCHR2基因siRNA腺病毒載體構(gòu)建、穩(wěn)定細(xì)胞株建立及其蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、肥胖癥作為一種營養(yǎng)代謝性疾病，是心腦血管疾病、糖尿病、高血壓、高脂血癥以及癌癥等多種疾病的高危因素，現(xiàn)已成為全球性的健康問題。多年來研究發(fā)現(xiàn)肥胖的發(fā)生與下丘腦對(duì)攝食的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)控密切相關(guān)，由下丘腦分泌的促食肽黑色素濃集激素（MCH）及其受體（MCHR1和MCHR2）的發(fā)現(xiàn)為肥胖發(fā)生機(jī)制及防治的研究提供了新的靶點(diǎn)。通過構(gòu)建轉(zhuǎn)基因和基因敲除動(dòng)物模型已對(duì)MCH及MCHR1與肥胖及能量代謝的關(guān)系進(jìn)行了深入細(xì)致的研究，但有關(guān)MCHR2的功能及其

2、與肥胖的關(guān)系至今仍不清楚。因此，本課題一方面構(gòu)建了靶向人MCHR2基因的siRNA重組腺病毒載體，以便從動(dòng)物水平研究MCHR2的功能；另一方面構(gòu)建了兩個(gè)穩(wěn)定表達(dá)MCHR2基因的細(xì)胞株：SH-SY5Y-MCHR2及SHG-44-MCHR2，并利用這兩個(gè)細(xì)胞株進(jìn)行MCHR2功能的蛋白質(zhì)組學(xué)研究，從細(xì)胞蛋白整體水平探討MCHR2功能及作用機(jī)制。研究內(nèi)容包括以下三個(gè)部分： 1.人MCHR2基因siRNA重組腺病毒載體的構(gòu)建與鑒定。方法：

3、人工合成靶向MCHR2的siRNA干擾序列，用分子克隆的方法克隆到穿梭載體p SES-HUS上得到p SES-HUS-MCHR2siRNA，并與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdeasy-1在BJ5183細(xì)菌中進(jìn)行同源重組得到pAdeasy-SES-HUS-MCHR2siRNA，在HEK293細(xì)胞中包裝成重組腺病毒，感染穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MCHR2的CHO細(xì)胞株CHO-MCHR2，RT-PCR及Western Blot檢測(cè)腺病毒對(duì)細(xì)胞MCHR2表達(dá)的影響。結(jié)果

4、：p SES-HUS-MCHR2siRNA經(jīng)KpnⅠ、EcoRⅤ雙酶切后只有8500bp左右的條帶，同時(shí)測(cè)序結(jié)果正確，證明構(gòu)建成功。重組腺病毒質(zhì)粒經(jīng)PacⅠ酶切后可見一條4.5kb和一條約30kb的條帶，表明同源重組成功。線性化同源重組的腺病毒，轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，于熒光顯微鏡下可見紅色熒光表達(dá)。Adeasy-MCHR2siRNA（50pfu/cell）處理CHO-MCHR2細(xì)胞48h后，RT-PCR及Western Blot檢測(cè)到MCHR

5、2在轉(zhuǎn)錄與蛋白水平的表達(dá)都明顯降低（相比Adeasy-SES-HUS對(duì)照組）。結(jié)論：成功構(gòu)建MCHR2siRNA重組腺病毒載體，Adeasy-MCHR2siRNA腺病毒能有效地抑制CHO-MCHR2細(xì)胞中MCHR2表達(dá)，能夠用于動(dòng)物水平研究MCHR2功能。 2.穩(wěn)定表達(dá)人MCHR2基因的SHG-44-MCHR2及SH-SY5Y-MCHR2細(xì)胞株的建立與鑒定。方法：①PCR法從人胎腦cDNA文庫擴(kuò)增MCHR2全長cDNA片段。用基

6、因重組方法將其克隆到pcDNA3.1（+），構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+）MCHR2，并用LipofectamineTM轉(zhuǎn)染到SHG-44細(xì)胞，通過G418篩選，建立穩(wěn)定表達(dá)MCHR2的SHG-44細(xì)胞系，命名為SHG-44-MCHR2，用RT-PCR、Western blot及免疫熒光法檢測(cè)MCHR2的表達(dá)，并檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ca2+流動(dòng)。②用基因重組方法將MCHR2全長cDNA克隆到質(zhì)粒pEGFPN1，構(gòu)建真核表達(dá)載體pEGFPN

7、1-MCHR2，并用LipofectamineTM轉(zhuǎn)染到SH-SY5Y細(xì)胞，通過G418篩選，建立穩(wěn)定表達(dá)MCHR2的SH-SY5Y-MCHR2細(xì)胞系命名為SH-SY5Y-MCHR2，采用RT-PCR、Western blot檢測(cè)MCHR2的表達(dá)并用激光共聚焦顯微鏡觀察融合蛋白亞細(xì)胞定位。結(jié)果：①擴(kuò)增出MCHR2全長cDNA；成功構(gòu)建pcDNA3.1-MCHR2；RT-PCR、Western blot及免疫熒光法檢測(cè)SHG-44-MCH

8、R2到MCHR2的表達(dá)，并準(zhǔn)確定位于細(xì)胞膜上。MCH作用于MCHR2后，可促使細(xì)胞內(nèi)鈣庫釋放Ca2+進(jìn)而使胞內(nèi)Ca2+濃度出現(xiàn)明顯而短暫的升高，Ca2+振蕩過程在MCH刺激后30～50s內(nèi)完成。②成功構(gòu)建真核表達(dá)載體pEGFPN1-MCHR2；RT-PCR、Western blot檢測(cè)到SH-SY5Y-MCHR2細(xì)胞MCHR2的表達(dá)，激光共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染pEGFPN1-MCHR2的SH-SY5Y-MCHR2細(xì)胞融合蛋白定位于細(xì)胞膜，

9、而轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pEGFPN1的SH-SY5Y細(xì)胞（命名為SH-SY5Y-mock）EGFP定位于全細(xì)胞。結(jié)論：成功建立了穩(wěn)定表達(dá)MCHR2基因的SHG-44-MCHR2及SH-SY5Y-MCHR2細(xì)胞株，為后續(xù)關(guān)于MCHR2功能的體外蛋白質(zhì)組學(xué)研究打下了基礎(chǔ)。 3.人MCHR2基因功能的蛋白質(zhì)組學(xué)研究。方法：通過雙向凝膠電泳分離MCH處理后的SHG-44-MCHR2細(xì)胞與其對(duì)照細(xì)胞SHG-44-mock、SH-SY5Y-MCHR2

10、細(xì)胞與其對(duì)照細(xì)胞SH-SY5Y-mock細(xì)胞總蛋白，并對(duì)2-DE條件進(jìn)行優(yōu)化，最終選取了SH-SY5Y-MCHR2細(xì)胞與其對(duì)照細(xì)胞SH-SY5Y-mock細(xì)胞PH3-10NL膠條（上樣量200μg）的電泳圖進(jìn)行PDQuest圖像分析，MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定，Mascot軟件查詢SWISS-PORT蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫；半定量RT-PCR檢測(cè)INSIG2、ACOT8、IDH3A、PCK1、PFKFB4 mRNA水平變化，Western blo

11、t在蛋白質(zhì)水平對(duì)IDH3A及PFKFB4進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果：MCH處理后的SH-SY5Y-MCHR2細(xì)胞與其對(duì)照細(xì)胞SH-SY5Y-mock細(xì)胞用PH3-10NL膠條（上樣量200μg）獲得分辨率高、重復(fù)性好的細(xì)胞雙向電泳圖譜，圖像分析顯示有43個(gè)蛋白斑點(diǎn)表達(dá)有差異，經(jīng)MALDI-TOF檢測(cè)，鑒定了34個(gè)可能蛋白，21個(gè)上調(diào)表達(dá)（IDH3A、PCK1、PFKFB4、ACSM5等），13個(gè)下調(diào)表達(dá)（INSIG2、ACOT8、RAB2B等）。M

12、CH處理后的SH-SY5Y-MCHR2細(xì)胞IDH3A、PCK1、PFKFB4 mRNA表達(dá)上調(diào)，而INSIG2、ACOT8mRNA表達(dá)下調(diào)。IDH3A、PFKFB4蛋白質(zhì)在MCH處理的SH-SY5Y-MCHR2細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)。結(jié)論：MCH處理后的SH-SY5Y-MCHR2細(xì)胞與其對(duì)照細(xì)胞SH-SY5Y-mock細(xì)胞有多種蛋白質(zhì)差異表達(dá)，這些蛋白質(zhì)參與細(xì)胞的脂代謝、糖代謝、能量代謝及細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)等多種信號(hào)通路，提示MCHR2可能通過這些蛋白質(zhì)