人類(lèi)白細(xì)胞抗原-G siRNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染JEG-3細(xì)胞株的建立.pdf

1、人類(lèi)白細(xì)胞抗原-G(humanleukocyteantigen-G，HLA-G)屬于非經(jīng)典人類(lèi)白細(xì)胞抗原Ⅰ類(lèi)分子，主要有3個(gè)特點(diǎn)：選擇性組織分布；有限的分子多態(tài)性；mRNA選擇性剪接形成不同的異構(gòu)體分子，分別編碼不同的蛋白質(zhì)分子亞型。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，HLA-G蛋白通過(guò)多種途徑參與維持正常妊娠，如HLA-G陽(yáng)性的細(xì)胞通過(guò)與妊娠期子宮蛻膜內(nèi)自然殺傷細(xì)胞(uNK)、細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)等細(xì)胞表面抑制性受體(killercellinhibito

2、ryreceptor，KIR)相互作用而抑制細(xì)胞毒作用；調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞因子釋放向Th2細(xì)胞因子極向轉(zhuǎn)化的過(guò)程；提高胚胎的卵裂速率等。HLA-G基因表達(dá)異常，會(huì)引起不孕，習(xí)慣性流產(chǎn)，先兆子癇等病理性妊娠。因此，HLA-G是人類(lèi)生殖中的重要調(diào)控蛋白，研究HLA-G在妊娠中的作用在人類(lèi)生殖生物學(xué)和生殖免疫學(xué)具有重要的理論意義，對(duì)于人類(lèi)輔助生殖技術(shù)具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。 RNA干擾(RNAinterference，RNAi)是一種

3、廣泛存在于生物體內(nèi)的由雙鏈RNA(double-strandedRNA,dsRNA)介導(dǎo)的、序列特異的同源基因轉(zhuǎn)錄后基因沉寂(post-transcriptionalgenesilencing，PTGS)現(xiàn)象。一般認(rèn)為，RNAi的作用機(jī)制是含有19-23個(gè)核苷酸對(duì)的小RNA片段，即小干擾RNA(smallinterferingRNA,siRNA)作為中介分子，與Dicer和其他一些蛋白質(zhì)共同構(gòu)成RNA誘導(dǎo)的沉寂復(fù)合物(RNAinduci

4、ngsuppresscomplex，RISC)，依靠堿基互補(bǔ)規(guī)律識(shí)別與siRNA同源的目的mRNA分子，并將其降解。目前RNAi作為一種新的基因反向遺傳研究的工具，具有高效、特異地抑制基因表達(dá)的特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于基因功能和基因治療等研究中。因此，采用RNA干擾技術(shù)研究HLA-G在人類(lèi)生殖中的生物學(xué)和免疫學(xué)功能具有良好的前景。 目的：1.篩選出能夠特異降調(diào)節(jié)JEG-3細(xì)胞中HLA-G表達(dá)的siRNA序列；2.構(gòu)建針對(duì)HLA-G的s

5、iRNA真核表達(dá)質(zhì)粒載體；3.建立HLA-G穩(wěn)定降調(diào)節(jié)的人絨癌JEG-3細(xì)胞株。 方法：1.依據(jù)siRNA設(shè)計(jì)原則，結(jié)合HLA-G基因的序列特征，借助生物信息軟件在線(xiàn)設(shè)計(jì)了兩對(duì)靶向HLA-G的siRNA，由公司化學(xué)合成。應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法分別將其轉(zhuǎn)染JEG-3細(xì)胞，48小時(shí)后通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)、RT-PCR及Western-blot等方法分別檢測(cè)兩對(duì)siRNA對(duì)JEG-3細(xì)胞中HLA-GmRNA和蛋白水平表達(dá)的影響；2.應(yīng)用基因重

6、組技術(shù)，將實(shí)驗(yàn)一篩選出的寡核苷酸序列插入質(zhì)粒pSilencer2.1-U6-neo，構(gòu)建HLA-GsiRNA真核表達(dá)質(zhì)粒載體pSilencer2.1-U6-neo-HLA-G(簡(jiǎn)稱(chēng)pSil-HLA-G)及陰性對(duì)照pSilencer2.1-U6-neo-ns(簡(jiǎn)稱(chēng)pSil-ns)，用限制性酶切質(zhì)粒和序列測(cè)定對(duì)其進(jìn)行鑒定。3.應(yīng)用脂質(zhì)體分別將質(zhì)粒pSil-HLA-GpSilencer2.1-U6-neo空載體、pSil-ns轉(zhuǎn)染JEG-3細(xì)

7、胞，應(yīng)用RT-PCR、Western-blot等方法鑒定轉(zhuǎn)染前后各組JEG-3細(xì)胞中HLA-GmRNA及蛋白表達(dá)水平有無(wú)變化。經(jīng)過(guò)G418抗性篩選，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。 結(jié)果：1.經(jīng)過(guò)流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometry，F(xiàn)CM)、RT-PCR和Western-blot等方法檢測(cè)，轉(zhuǎn)染HLA-GsiRNA后的JEG-3細(xì)胞中HLA-G的表達(dá)明顯下降，成功篩選出有效特異抑制HLA-G表達(dá)的siRNA基因序列；2.限制性酶切重組質(zhì)

8、粒及測(cè)序結(jié)果證實(shí)：正確的把目的片段插入質(zhì)粒pSilencer2.1-U6-neo，成功地構(gòu)建了HLA-G基因siRNA的真核表達(dá)質(zhì)粒載體pSil-HLA-G；3.轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞能夠抵抗G418的壓力，HLA-G的表達(dá)明顯下調(diào)，成功的建立了能夠穩(wěn)定降調(diào)節(jié)HLA-G基因表達(dá)的JEG-3細(xì)胞株。 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)利用RNAi技術(shù)，成功地篩選出能夠特異抑制HLA-G基因表達(dá)的siRNA基因序列；成功構(gòu)建了pSil-HLA-G重組質(zhì)粒；建立了穩(wěn)