大蒜素對人骨肉瘤細胞株Saos-2細胞作用效果的蛋白質(zhì)組學研究.pdf

1、研究背景 骨肉瘤是常見的原發(fā)性骨惡性腫瘤，好發(fā)于青少年，由于腫瘤呈浸潤性生長，使各種治療手段均難以達到根治程度。1970年以前標準治療是截肢術，但5年生存率僅約為10％。近30年來，隨著新輔助化療的廣泛應用，骨肉瘤的5年生存率已達60％。我國目前未行術前化療者復發(fā)率在30％左右，應用術前化療后60％～70％患者得以保肢。一些研究還表明，新輔助化療聯(lián)合保肢手術治療后的患者，其5年生存率可達70％。而我們的臨床研究也發(fā)現(xiàn)，應用新輔助

2、化療和保肢手術治療后(隨訪時間平均為47個月)，患者的無瘤生存率為54.5％。因此，盡管化療在骨肉瘤治療中具有舉足輕重的地位并取得了可喜的成就，但是骨肉瘤化療總體有效率仍徘徊在60％左右。制約其療效的主要因素在于兩個方面，一是高劑量強度化療藥物所導致的嚴重毒副作用，如骨髓抑制、胃腸道反應、心臟毒性、肝臟毒性、腎臟及膀胱毒性、神經(jīng)系統(tǒng)毒性、過敏反應及皮膚毒性、肺部不良反應等；二是腫瘤細胞原發(fā)或繼發(fā)的耐藥問題。因此，開發(fā)和選用毒副作用低、骨

3、肉瘤細胞沒有耐藥性或耐藥性較低的藥物成為當前骨肉瘤化療新的突破點。 大蒜素(diallyl trisulfide，DATS，化學名二烯丙基三硫化物)，是從粉碎新鮮大蒜中提取的一種有機硫化合物，具有良好的抗腫瘤作用。許多研究結(jié)果表明，大蒜素抗腫瘤的作用機理主要是兩個方面：停滯細胞周期和/或誘導細胞凋亡。通過對細胞周期依賴性激酶(Cdks)和細胞周期調(diào)節(jié)蛋白(cyclins)的調(diào)節(jié)來阻止細胞有絲分裂、停滯細胞周期；通過線粒體信號途徑

4、(主要是影響B(tài)cl-2家族)、鈣離子信號途徑、氧化應激途徑來激活caspase活性，最終誘導細胞凋亡，從而達到抑制細胞增殖的目的。但是就目前的研究來看，針對大蒜素的應用似乎局限于了腺上皮來源的癌，沒有相關的資料證明大蒜素抑制腫瘤生長有部位或組織來源的選擇性。因此，本課題以人骨肉瘤細胞株Saos-2細胞為研究對象，進行體外實驗，以研究大蒜素對人骨肉瘤細胞株的作用效果，并探討其抑制人骨肉瘤細胞增殖的作用機理。本研究首次將大蒜素應用到治療骨肉

5、瘤的實驗研究當中，并用目前的熱點研究手段-蛋白質(zhì)組學技術來探討大蒜素對骨肉瘤細胞的作用機理，不僅拓展了大蒜素抗腫瘤的作用范圍，并可為藥物治療骨肉瘤提供新的研究方向。本研究大體可分為兩個部分：一、大蒜素對人骨肉瘤細胞株Saos-2細胞增殖抑制作用的實驗研究目的盡管目前許多的研究已經(jīng)表明，大蒜素可通過停滯細胞周期和/或誘導細胞凋亡達到抑制細胞增殖的目的。但是就目前的研究來看，針對大蒜素的應用似乎局限于了腺上皮來源的癌，沒有相關的資料證明大蒜

6、素抑制腫瘤生長有部位或組織來源的選擇性。 本研究的目的就是以人骨肉瘤細胞株Saos-2細胞為研究對象，應用各種不同的方法檢測大蒜素作用后，Saos-2細胞形態(tài)及細胞周期、細胞凋亡等細胞生物學特征的變化，并通過這些變化來分析大蒜素對人骨肉瘤細胞株Saos-2細胞增殖的抑制效果。 方法： 1倒置顯微鏡觀察不同濃度的大蒜素作用不同時間段后，Saos-2細胞形態(tài)變化。 2不同濃度的大蒜素作用于Saos-2細胞不同

7、時間段后，MTT法檢測大蒜素對細胞增值的抑制效果。 3不同濃度的大蒜素作用于Saos-2細胞不同時間段后，應用流式細胞儀檢測Saos-2細胞周期。 4不同濃度的大蒜素作用于Saos-2細胞不同時間段后，應用流式細胞儀檢測Saos-2細胞凋亡。 結(jié)果： 1不同濃度的大蒜素作用不同時間段后，Saos-2細胞的形態(tài)變化將25μM，50μM，100μM大蒜素加入到人骨肉瘤細胞株Saos-2細胞的培養(yǎng)基中，分別處理

8、24、48、72和96小時后，倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組細胞排列規(guī)則，連接緊密，大小均勻，細胞形態(tài)及胞膜界限清晰，核呈圓形并位于細胞中央。而大蒜素組細胞之間連接減少，形態(tài)不規(guī)則，內(nèi)部顆粒增多，部分細胞變圓、皺縮，胞膜外突，并出現(xiàn)脫落死亡細胞。隨著濃度的增加和時間的延長，上述改變更加明顯。 2.大蒜素對Saos-2細胞增殖的影響25μM，50μM，100μM大蒜素分別處理24、48、72和96小時后，MTT法檢測

9、細胞增殖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大蒜素對Saos-2細胞生長有明顯的抑制作用，與空白組對比有顯著性差異，并且有濃度和時間的依賴性。 3大蒜素對Saos-2細胞周期的影響25μM，50μM，100μM大蒜素分別處理24、48、72和96小時后，流式細胞儀檢測細胞周期發(fā)現(xiàn)，大蒜素可使Saos-2細胞停滯在G0/G1期，并且隨著濃度和時間的增加，停滯在G0/G1期的細胞比例也隨之增加。 4大蒜素對Saos-2細胞凋亡的影響25μM，50μ

10、M，100μM大蒜素分別處理24、48、72和96小時后，流式細胞儀檢測細胞凋亡發(fā)現(xiàn)，大蒜素可誘導細胞凋亡，并且其作用效果有一定的濃度和時間相關性。 二、大蒜素抑制人骨肉瘤細胞株saos-2細胞增殖的分子機制研究 目的：通過大蒜素對人骨肉瘤細胞株Saos-2細胞增殖抑制作用的實驗研究，我們可以得出這樣的結(jié)論，大蒜素可通過停滯細胞周期進程和/或誘導細胞凋亡以達到其抑制Saos-2細胞增殖的作用效果。 本研究的目的就

11、是運用蛋白質(zhì)組學技術，從蛋白水平檢測、分析人骨肉瘤細胞周期和/或細胞凋亡相關蛋白的變化，探討大蒜素抑制人骨肉瘤細胞增殖的分子作用機制。 方法： 1.50μM大蒜素作用于Saos-2細胞48小時后，提取細胞總蛋白，雙向凝膠電泳技術(two-dimensional electrophoresis，2-DE)初步分析大蒜素作用前后的蛋白質(zhì)表達變化。 2.切取表達變化顯著的蛋白質(zhì)點轉(zhuǎn)入質(zhì)譜分析，得出新的或已知的蛋白質(zhì)。

12、 結(jié)果： 1.雙向凝膠電泳從Saos-2細胞中提取的蛋白在2-DE上得到很好的解析。在2-DE圖像上，50μM大蒜素組和對照組Saos-2細胞總蛋白在相同的模式中電泳。2-DE圖像掃描后，ImageMaster 2D Platinum進行分析，對照組和實驗組得到的總的點數(shù)分別為316±6(n=3)和310±3(n=3)。點容積3倍的變化，設定為顯著變化的界限。結(jié)果共有36個點被認為是對大蒜素敏感的，其中22個點是下調(diào)的，1

13、4個點是上調(diào)的。 2質(zhì)譜分析切取36個對大蒜素敏感的點，胰蛋白酶消化后，轉(zhuǎn)入基質(zhì)輔助激光解析/電離飛行時間質(zhì)譜分析(MALDI-TOF MS)。根據(jù)質(zhì)譜儀所得的數(shù)據(jù)，27個點與蛋白質(zhì)匹配，其中包括下調(diào)18個，上調(diào)9個。這些蛋白參與到許多細胞生物學進程中，比如細胞生長周期和凋亡、細胞構架和基礎代謝、以及蛋白合成和分解等。 結(jié)論： 本課題首次將大蒜素應用到治療骨肉瘤的實驗研究當中，以人骨肉瘤細胞株Saos-2細胞為研究對象，

14、進行體外實驗，倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化，MTT法檢測大蒜素對細胞增值的抑制效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大蒜素可抑制Saos-2細胞的增殖，并有濃度和時間的依賴性。流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)大蒜素可使Saos-2細胞停滯在G0/G1期，并且可誘導細胞凋亡。進一步應用雙向電泳和質(zhì)譜分析技術研究發(fā)現(xiàn)，大蒜素可使Saos-2細胞的一些蛋白表達發(fā)生顯著變化，而這些蛋白在許多細胞生物學進程中發(fā)揮重要的作用。 本研究表明，大蒜素可通過停滯細胞周期進程和/或誘導細