CyclinE干擾RNA對肝癌HepG2細(xì)胞株蛋白質(zhì)組的影響.pdf

1、目的：用干擾RNA抑制CyelinE的表達(dá)，對CyelinE表達(dá)受抑制后產(chǎn)生的一些效應(yīng)進(jìn)行觀察分析，并用雙向凝膠電泳和質(zhì)譜技術(shù)分析鑒定轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)組的表達(dá)差異，探討CyclinE在肝癌細(xì)胞增殖中的作用，為肝癌發(fā)病機(jī)理的研究以及早期診斷、治療提供參考依據(jù)。 方法： 1.構(gòu)建質(zhì)粒表達(dá)載體pU6-cyclinE-shRNA，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細(xì)胞株，獲得HepG2-cyclinEshRNA細(xì)胞系，檢測其cyclin

2、E基因表達(dá)情況及細(xì)胞生長曲線、細(xì)胞周期的改變。 2.裂解HepG2-cyclinEshRNA細(xì)胞和G1期肝癌HepG2細(xì)胞，抽提細(xì)胞全蛋白，分別進(jìn)行3次雙向電泳進(jìn)行分離，以其中2-DE效果好、點(diǎn)數(shù)多的一塊膠作為參考膠，進(jìn)行2組間的匹配分析，篩選出兩組間差異6倍及以上且出現(xiàn)頻率大于等于50％的蛋白點(diǎn)，并應(yīng)用MALDI-TOF-MS和數(shù)據(jù)庫搜索鑒定差異顯著的蛋白點(diǎn)。 結(jié)果： 1.HepG2-cyclinEshRNA細(xì)

3、胞與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒HepG2細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞相比，生長速度減慢，GOG1期細(xì)胞增多，G2/M和S期細(xì)胞減少。 2.相同條件下雙向電泳后，G1期肝癌HepG2細(xì)胞株平均檢測到435+51(n=3)個蛋白點(diǎn)，HepG2-cy-clinEshRNA細(xì)胞376±44(n=3)個，Proxpress2D軟件分析得到差異蛋白點(diǎn)15個。應(yīng)用質(zhì)譜鑒定出角蛋白19、波形蛋白、神經(jīng)多肽h3等8個蛋白點(diǎn)。 結(jié)論： 1.cycl