仔豬生精細胞體外培養(yǎng)、增殖及分化研究.pdf

1、本實驗通過比較兩種生精細胞(spermatogeneniccell)的培養(yǎng)方法，觀察生精細胞體外培養(yǎng)過程中的生長行為，并檢測增殖分化情況，以建立精子發(fā)生體外培養(yǎng)系統(tǒng)，為進一步研究精子發(fā)生機理奠定基礎(chǔ)，并為治療雄性不孕、闡明環(huán)境污染物對雄性生殖的損害提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，還能為制備轉(zhuǎn)基因動物、挽救瀕危野生動物提供新的思路。 采用生精細胞混合培養(yǎng)和組織塊培養(yǎng)進行仔豬睪丸生精細胞體外培養(yǎng)，分別從生精細胞在體外培養(yǎng)過程存活率、存活時間及分化程度

2、等方面進行比較。結(jié)果顯示生精細胞混合培養(yǎng)過程中，檢測第1d)存活率為(91.66±0.46)％，第2d存活率達到(95.41±1.11)％，第3d存活率降低為(94.15±0.32)％；組織塊培養(yǎng)中生精細胞存活率一直較高且穩(wěn)定，檢測第1d存活率為(96±0.58)％，隨著培養(yǎng)時間延長，存活率逐步上升，第2d、3d存活率均為98％，與混合培養(yǎng)存活率相比，存活率差異極顯著(F=62.15，P＜0.001；q=3.59，P＜0.001)；生精

3、細胞混合培養(yǎng)5d后，生精細胞分化的最高程度為次級精母細胞，組織塊培養(yǎng)9d后生精細胞分化的最高程度為四分體精子細胞。 為了進一步了解睪丸組織塊培養(yǎng)體系中生精細胞增殖及分化情況。本實驗采取以下培養(yǎng)條件：DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基，每毫升培養(yǎng)液中含有100IU青鏈霉素、Vc(10-4M)、VE(10μg/ml)、FSH(10-4mg/ml)、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白(10μg/ml)，34℃，5％CO2，95％空氣二氧化碳培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，對

4、仔豬睪丸組織塊進行了2～4周體外培養(yǎng)。通過溴脫氧核苷尿嘧啶(5'-Bromo-2-deoxyuridine，BrdU)體外標記S期生精細胞DNA，細胞免疫熒光技術(shù)檢測生精細胞體外增殖情況；采用HE染色及透射電子顯微鏡技術(shù)從普通生態(tài)學及超微結(jié)構(gòu)兩個方面檢測體外培養(yǎng)前后生精細胞分化程度。結(jié)果顯示：(1)Brdu標記檢測發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)過15d，20d體外培養(yǎng)后生精細胞增殖明顯，體外培養(yǎng)15d可見大部分生精細胞以集落形式存在，呈念珠狀或啞鈴狀，少數(shù)

5、細胞以單細胞形式存在，集落包含有2-cell、4-cell、6-cell等偶數(shù)生精細胞集落，也包含奇數(shù)細胞個數(shù)的細胞集落，如3-cell、5-cell、9-cell等，主要為小于10-cell細胞集落。體外培養(yǎng)20d，熒光顯微鏡圖顯示，仍可見許多細胞集落，集落多為2-cell及單個的生精細胞。(2)HE染色結(jié)果顯示，體外培養(yǎng)15d，精原細胞通過間橋連接附著于支持細胞上，支持細胞核不規(guī)則，以2個核仁常見，偶見正在分裂的次級精母細胞，未見精

6、子細胞；體外培養(yǎng)第20d，可見多個正在分裂的次級精母細胞，還觀察到Sb、Sc型精子細胞，Sb型精子細胞胞核為圓形，胞核為藍紫色，胞核略微偏向一極；Sc型精子細胞胞核卵圓形，藍紫色，核偏極程度比Sc嚴重，染色質(zhì)較Sb致密。(3)透射電子顯微鏡結(jié)果表明支持細胞胞質(zhì)不如培養(yǎng)前豐富，線粒體明顯減少、輕度腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)無明顯變化。體外培養(yǎng)后觀察到了2個典型精子細胞，胞核呈“蘋果”狀，在細胞核頂端有高電子密度頂體囊泡形成，胞核一側(cè)可見高爾基體、線粒體