體外培養(yǎng)生精細(xì)胞的增殖分化效應(yīng)及顯微授精研究.pdf

1、第一部分 改良培養(yǎng)基對(duì)體外培養(yǎng)生精細(xì)胞的增殖分化效應(yīng)
　　目的:通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)的改進(jìn)探討新生小鼠睪丸組織生精細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下的增殖分化效應(yīng),以期提高生精細(xì)胞體外存活率,增殖率、分化率及存活時(shí)間。
　　方法:對(duì)7~8日齡小鼠生精細(xì)胞進(jìn)行混合細(xì)胞培養(yǎng),采用基礎(chǔ)培養(yǎng)液(A組)、條件培養(yǎng)液(B組)(基礎(chǔ)培養(yǎng)液+20 ng/ml EGF+10 ng/ml GDNF)、分別含濃度為20％、40%、80%睪丸液(testicular

2、 abstract,TA)的基礎(chǔ)培養(yǎng)液(C1、C2和C3組)和分別含濃度為20%、40%、80%TA的條件培養(yǎng)液(D1、D2和D3組),通過(guò)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、存活率和粗線期精母細(xì)胞特異性基因P19、單倍體精子細(xì)胞特異性基因TP1檢測(cè)及染色體倍性分析,探討TA、GDNF和EGF對(duì)小鼠生精細(xì)胞體外培養(yǎng)增殖分化效應(yīng)。
　　結(jié)果:①形態(tài)學(xué)觀察 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組在培養(yǎng)3~4天后均可觀察到正在分裂的細(xì)胞。B組培養(yǎng)7~8天后可觀察到細(xì)胞集落,集落間

3、可見(jiàn)散在圓形精子細(xì)胞,培養(yǎng)10天后,細(xì)胞集落爆發(fā)出現(xiàn),并可見(jiàn)變形精子細(xì)胞和帶鞭毛精子細(xì)胞,培養(yǎng)20天后,可見(jiàn)部分生精細(xì)胞和支持細(xì)胞凋亡。含TA(C1、C2 和 C3)組和(D1、D2和D3)組細(xì)胞生長(zhǎng)速度介于A組和B組之間,培養(yǎng)7~8天后也可見(jiàn)少量細(xì)胞集落,其中正在分裂細(xì)胞偏多,圓形精子細(xì)胞少見(jiàn),培養(yǎng)10天后,細(xì)胞集落增加,并可觀察到各期生精細(xì)胞,但細(xì)胞密度低于B組,培養(yǎng)15天后,細(xì)胞集落鋪滿培養(yǎng)皿底部。對(duì)實(shí)驗(yàn)各組傳代培養(yǎng),A組傳代后細(xì)

4、胞生長(zhǎng)不良,B組傳代至2~3代后細(xì)胞生長(zhǎng)明顯減慢,且細(xì)胞暗沉發(fā)黑、貼壁性差,而C1、C2、C3組和D1、D2、D3組傳代培養(yǎng)4個(gè)月之后仍可觀察到細(xì)胞生長(zhǎng)。②生精細(xì)胞計(jì)數(shù) 培養(yǎng)各時(shí)間階段B組生精細(xì)胞數(shù)均顯著高于其余組(P<0.05),而A組生精細(xì)胞數(shù)則顯著低于其余各組(P<0.05),其余各組間無(wú)顯著性差異;③生精細(xì)胞存活率 培養(yǎng)第5、10和15天A與B組間細(xì)胞存活率無(wú)顯著性差異,但培養(yǎng)第20天A組細(xì)胞存活率顯著低于B組(P<0.05),

5、其余組在培養(yǎng)各階段與A、B組相比細(xì)胞存活率無(wú)顯著性差異;④TP1/P19 A組在培養(yǎng)15天時(shí)TP1/P19顯著高于B組(P<0.05),B組在培養(yǎng)20天時(shí)顯著高于其余組(P<0.05),其余各培養(yǎng)組均無(wú)顯著性差異;⑤單倍體精子細(xì)胞比例 B組在培養(yǎng)第15天和20天時(shí)單倍體細(xì)胞比顯著高于其余組(P<0.05),其余各培養(yǎng)組均無(wú)顯著性差異。
　　結(jié)論:在生精細(xì)胞與支持細(xì)胞混合培養(yǎng)體系中,基礎(chǔ)培養(yǎng)液中添加適量GDNF和EGF可顯著提高生精

6、細(xì)胞體外培養(yǎng)的增殖分化效應(yīng),但不能延長(zhǎng)其體外培養(yǎng)時(shí)間;基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入適量TA,可增加生精細(xì)胞體外培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)及時(shí)間;在含最佳濃度細(xì)胞因子培養(yǎng)液中加入適量TA,降低生精細(xì)胞體外培養(yǎng)增殖分化效應(yīng),但顯著增加生精細(xì)胞體外培養(yǎng)的時(shí)間。
　　第二部分 體外培養(yǎng)生精細(xì)胞的顯微授精研究
　　目的:對(duì)體外培養(yǎng)獲得的圓形和長(zhǎng)形精子細(xì)胞行卵胞漿內(nèi)顯微注射術(shù)(round spermatid injection,ROSI;elongated sp

7、ermatid injection,ELSI),觀察其受精率、卵裂率、桑囊胚形成率,探討體外培養(yǎng)所獲單倍體精子細(xì)胞的受精能力以及受精后胚胎的發(fā)育潛能。
　　方法:對(duì)7~8日齡小鼠生精細(xì)胞混合細(xì)胞體外培養(yǎng)后獲得的圓形/長(zhǎng)形精子細(xì)胞和成年小鼠睪丸內(nèi)的圓形和長(zhǎng)形精子細(xì)胞以及成熟精子進(jìn)行卵胞漿內(nèi)顯微授精,比較其受精率、卵裂率及桑囊胚形成率。
　　結(jié)果:成年小鼠睪丸內(nèi)單倍體精子細(xì)胞和體外培養(yǎng)獲得的單倍體精子細(xì)胞行ROSI/ELSI后,