水牛精原細(xì)胞體外培養(yǎng)及分化的相關(guān)性研究.pdf

1、為建立水牛精原細(xì)胞體外培養(yǎng)及分化的培養(yǎng)體系，本研究以本地水牛睪丸為材料，進(jìn)行了如下研究：
　　 (1)探討了初情期前的水牛曲精細(xì)管發(fā)育與管中細(xì)胞類型變化的關(guān)系，以及水牛精原細(xì)胞體外檢測(cè)的方法。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，水牛曲精細(xì)管直徑在50-62.5μm之間均沒(méi)有檢測(cè)到其管中細(xì)胞PGP9.5、c—Kit、p19、TP1和PRM2基因的表達(dá)；曲精細(xì)管直徑=75μm時(shí)檢測(cè)到其管中細(xì)胞PGP9.5和c—Kit基因的表達(dá)，此時(shí)出現(xiàn)精原細(xì)胞；曲精細(xì)管直徑

2、=87.5μm時(shí)檢測(cè)到其管中細(xì)胞p19基因的表達(dá)，此時(shí)出現(xiàn)精母細(xì)胞；曲精細(xì)管直徑=10μm時(shí)檢測(cè)到其管中細(xì)胞TP1和PRM2基因的表達(dá)，此時(shí)出現(xiàn)精子細(xì)胞；大多數(shù)精原細(xì)胞呈c—Kit陽(yáng)性，部分精原細(xì)胞呈PGP9.5陽(yáng)性，精原細(xì)胞呈GATA4陰性，支持細(xì)胞呈GATA4陽(yáng)性。以上結(jié)果表明，隨著水牛睪丸曲精細(xì)管的發(fā)育，其細(xì)胞組合類型發(fā)生明顯改變，根據(jù)曲精細(xì)管直徑大小來(lái)判斷初情期前水牛管中各級(jí)生精細(xì)胞首次出現(xiàn)時(shí)間是一個(gè)可靠的方法；可以通過(guò)c—Ki

3、t、PGP9.5、GATA4免疫染色及細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征的方法來(lái)檢測(cè)水牛睪丸支持細(xì)胞和精原細(xì)胞。
　　 (2)探討了水牛精原細(xì)胞體外培養(yǎng)及分化的影響因素及其體外發(fā)育的潛能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)液中添加2.5％～10％胎牛血清(FBS)能顯著提高精原細(xì)胞的存活率(P<0.05)；精原細(xì)胞培養(yǎng)在34℃和37℃下的存活率之間沒(méi)有顯著差異(P>0.05)；培養(yǎng)液中添加3.3×10-7mol/L維生素A能顯著提高培養(yǎng)4d后的精原細(xì)胞存活率(P<0.

4、05)，但不能顯著提高似精子細(xì)胞形成率(P>0.05)；培養(yǎng)液中添加5U/L促卵泡素(FSH)能顯著提高培養(yǎng)40d后的似精子細(xì)胞形成率(P<0.05)；培養(yǎng)液中添加0.1μmol/L睪酮(T)能顯著提高培養(yǎng)41d后的似精子細(xì)胞形成率(P<0.05)；精原細(xì)胞體外培養(yǎng)4wk后出現(xiàn)8.0～10.0μm的似圓形精子細(xì)胞，培養(yǎng)5wk后出現(xiàn)具鞭毛狀結(jié)構(gòu)的似精子細(xì)胞；似精子細(xì)胞注入水牛卵母細(xì)胞內(nèi)形成的重構(gòu)胚可進(jìn)一步發(fā)育為囊胚；RT—PCR檢測(cè)到培養(yǎng)

5、后細(xì)胞的單倍體精子細(xì)胞特異基因PRM2的表達(dá)，證實(shí)了水牛精原細(xì)胞經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期培養(yǎng)后形成了精子細(xì)胞。以上結(jié)果表明，在37℃，5％CO2和飽和濕度條件下培養(yǎng)水牛精原細(xì)胞，培養(yǎng)液中添加10％FBS、3.3×10-7mol/L維生素A、5U/L FSH和0.1μmol/L T能滿足精原細(xì)胞體外長(zhǎng)期培養(yǎng)的需要，并可以發(fā)生增殖與分化最終形成精子細(xì)胞。
　　 (3)探討了水牛生精上皮細(xì)胞冷凍保存的適宜冷凍保護(hù)劑及其濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)以0％、5％、

6、10％、15％、20％二甲基亞砜(DMSO)添加時(shí)，10％DMSO組的細(xì)胞解凍后存活率均顯著高于其它各組(P<0.05)；當(dāng)以0％、20％、25％、30％、35％、40％甘油(G)添加時(shí)，35％G組的細(xì)胞解凍后存活率均顯著高于其它各組(P<0.05)；當(dāng)以0％、5％、10％、15％、20％、25％丙二醇(PG)添加時(shí)，15％～25％PG各組的細(xì)胞解凍后存活率均顯著高于其它各組(P<0.05)，但以20％PG組的細(xì)胞存活率為最高；當(dāng)以0％

7、、5％、10％、15％、20％乙二醇(EG)添加時(shí)，5％～20％EG各組的細(xì)胞解凍后存活率均顯著高于0％EG組(P<0.05)，但以10％EG組的細(xì)胞存活率為最高；當(dāng)分別以5％、10％、15％、20％EG聯(lián)合10％DMSO添加時(shí)，10％EG+10％DMSO組的細(xì)胞解凍后存活率為最高，且均顯著高于15％EG+10％DMSO組和20％EG+10％DMSO組(P<0.05)；當(dāng)分別以0.07M、0.14M、0.21M、0.28M、0.35M蔗

8、糖聯(lián)合10％DMSO添加時(shí)，以0.28M蔗糖+10％DMSO組的細(xì)胞解凍后存活率為最高，且0.21M蔗糖+10％DMSO組和0.28M蔗糖+10％DMSO組的細(xì)胞解凍后存活率均顯著高于0.07M蔗糖+10％DMSO組(P<0.05)；而對(duì)5種冷凍保護(hù)劑各最優(yōu)濃度組或組合的細(xì)胞解凍后存活率比較，10％DMSO、0.28M蔗糖+10％DMSO、35％G組的細(xì)胞存活率均顯著高于20％PG、10％EG、10％EG+10％DMSO組(P<0.05

9、)，但以35％G組的細(xì)胞存活率為最高，達(dá)(74.17±1.83)％。以上結(jié)果表明，在含10％FBS的DMEM液中添加10％DMSO或35％G作為冷凍液，采用兩步慢速冷凍，液氮保存，37℃水浴解凍，是一種具有較高復(fù)蘇率的冷凍保存水牛生精上皮細(xì)胞的方法。
　　 (4)利用激光光鑷?yán)庾V技術(shù)探討了水牛精子發(fā)生過(guò)程中生精細(xì)胞內(nèi)分子物質(zhì)在生物化學(xué)上的變化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，成年水牛精子發(fā)生中各級(jí)生精細(xì)胞光譜都具有一些共有或特有的特征峰，部分

10、峰的強(qiáng)度隨著生精細(xì)胞發(fā)育而出現(xiàn)明顯加強(qiáng)或減弱的現(xiàn)象，每個(gè)峰均代表一種分子物質(zhì)，其中470和786cm-1峰所對(duì)應(yīng)肝糖和DNA濃度水平在精子發(fā)生中均出現(xiàn)了有規(guī)律的變化；在細(xì)胞差異光譜的比較中，體外培養(yǎng)前后精原細(xì)胞與似精子細(xì)胞之間的差異光譜和成年水牛精原細(xì)胞與精子細(xì)胞之間的差異光譜，兩者差異光譜的強(qiáng)度和變化趨勢(shì)最為接近，而和成年水牛其它各級(jí)生精細(xì)胞之間的差異光譜分別比較，光譜的強(qiáng)度與變化趨勢(shì)都極不相同，證實(shí)了3—5月齡水牛精原細(xì)胞經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期體