山羊精原細(xì)胞體外分離及培養(yǎng)分化與移植.pdf

1、　　作為成年動(dòng)物體內(nèi)唯一能進(jìn)行終生自我更新且遺傳親代基因給子代的一類二倍體永生細(xì)胞群，精原干細(xì)胞(SSCs)持續(xù)、高產(chǎn)的精子發(fā)生進(jìn)程使其成為體外操作的理想宿主干細(xì)胞，十年來(lái)各種屬動(dòng)物的成功移植有力促進(jìn)了相關(guān)技術(shù)的完善與發(fā)展。為了給后續(xù)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)提供理論依據(jù)和技術(shù)方法，本實(shí)驗(yàn)主要進(jìn)行山羊精原干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與移植研究，結(jié)果如下：1、采用四種酶組合分離二月齡關(guān)中奶山羊精原細(xì)胞，A組：膠原酶Ⅳ；B組：膠原酶Ⅳ+透明質(zhì)酸酶；C組：膠原酶

2、Ⅳ+透明質(zhì)酸酶+胰蛋白酶與EDTA；D組：膠原酶Ⅳ+透明質(zhì)酸酶+胰蛋白酶與EDTA+DnaseⅠ。結(jié)果C、D組不但組織塊解離效果及細(xì)胞離散程度均較A、B好，且原代培養(yǎng)細(xì)胞團(tuán)塊數(shù)少。多重比較C、D組顯著優(yōu)于A、B組；C組與D組差異不顯著，但與A、B組比較細(xì)胞存活率、圓形細(xì)胞比率及貼壁率差異極顯著，結(jié)果膠原酶Ⅳ+透明質(zhì)酸酶+胰蛋白酶與EDTA是較經(jīng)濟(jì)有效的山羊SSCs分離酶組合?！　?、為探索山羊SSCs體外培養(yǎng)體系，我們收集2月齡關(guān)中奶

3、山羊睪丸，一步酶法消化分離曲細(xì)精管細(xì)胞，臺(tái)盼蘭檢測(cè)平均存活率82.7﹪，以1×106/ml接種含15﹪胎牛血清(FBS)DMEM/F12培養(yǎng)瓶，37℃，5﹪CO2和飽和濕度條件下培養(yǎng)，4wk后FBS逐漸降至10﹪。原代培養(yǎng)以多突起和片狀的睪丸體細(xì)胞鋪壁生長(zhǎng)為主，10d左右精原干細(xì)胞數(shù)量增加，可見二聯(lián)體和四聯(lián)體，3wk左右有鳥巢狀和山脈狀集落形成，堿性磷酸酶染色陽(yáng)性，培養(yǎng)30d集落數(shù)不斷增加，散在分布有貼壁和漂浮精子，換液后精子丟失。挑取

4、單集落重新接種鋪壁的曲細(xì)精管體細(xì)胞飼養(yǎng)層后陸續(xù)有精子細(xì)胞及精子形成，主要分布于集落周圍。　　3、為掌握山羊SSCs睪丸移植適用方法，我們采用兩步酶法消化分離2～3月齡SSCs，以6.5×106/ml分別通過(guò)睪丸輸出管、B超介導(dǎo)睪丸網(wǎng)(多點(diǎn)和單點(diǎn))和徒手睪丸網(wǎng)三種方法移植。結(jié)果經(jīng)過(guò)輸出管幾乎不能移植細(xì)胞進(jìn)曲細(xì)精管，B超介導(dǎo)睪丸網(wǎng)移植每枚睪丸可移植約4.5ml細(xì)胞混合物，覆蓋曲細(xì)精管35～40﹪，徒手最多移植了6ml，曲細(xì)精管覆蓋率最高達(dá)