黃芪次生代謝途徑調(diào)控誘導(dǎo)子篩選及轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究.pdf

1、黃芪(Astragalus membranaceus(Fisch.) Bge.）是中國(guó)北方的重要藥用植物，廣泛應(yīng)用于臨床配方，具有強(qiáng)心、抗心肌缺血、提高免疫力、降糖、抗衰老、保護(hù)臟器等多種藥理作用。黃芪的藥效活性成分主要有多糖，皂苷、黃酮等次生代謝產(chǎn)物?，F(xiàn)在黃芪次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)主要來(lái)源于植物材料的直接浸提，但植物次生代謝產(chǎn)物的低產(chǎn)量一直是一個(gè)很難解決的重要問(wèn)題。由于缺乏基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，黃芪具有生物活性的次生代謝物質(zhì)合成途徑未知。次

2、生代謝生物合成途徑的候選基因和重要調(diào)控因子的鑒定，將會(huì)有助于理解次生代謝產(chǎn)物生物合成的途徑。
　　為了使黃芪次生代謝途徑能從正常的代謝背景中突出，并被捕捉到進(jìn)行研究。本研究利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以黃芪多糖含量、黃芪皂苷含量、黃芪黃酮含量為衡量指標(biāo)，對(duì)調(diào)控相應(yīng)代謝途徑的誘導(dǎo)子進(jìn)行了篩選。正交試驗(yàn)結(jié)果表明，黃芪多糖代謝途徑的最佳誘導(dǎo)子是硝酸銀溶液，最佳處理部位是地下部分，最佳處理時(shí)間是6-9d，最佳多糖含量變化檢測(cè)部位是黃芪根部。黃芪皂苷

3、代謝途徑的最佳誘導(dǎo)子是茉莉酸甲酯和內(nèi)生菌發(fā)酵液，處理部位是地下部位，最佳處理時(shí)間是3d，最佳皂苷含量變化檢測(cè)部位是黃芪根部。黃芪黃酮次生代謝途徑最佳的誘導(dǎo)子是硝酸銀溶液，最佳處理部位是地下部分，最佳處理時(shí)間是9d，最佳黃酮含量變化檢測(cè)部位是葉片。
　　同時(shí)本研究利用454/Roche GS FLX測(cè)序技術(shù)對(duì)黃芪植株根、莖、葉等比例總RNA混樣進(jìn)行了1/2板的轉(zhuǎn)錄組從頭測(cè)序。這1/2板的測(cè)序共得到742721條高質(zhì)量reads，平均

4、長(zhǎng)度413bp，約86％的reads參與了拼接，拼接的N50長(zhǎng)度為1205。通過(guò)比對(duì)共得到9893個(gè)unigene。全部unigene通過(guò)BLASTX軟件和三大公共數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，9732個(gè)unigene被成功注釋?zhuān)⑨屄蕿?8.37％。利用KEGG對(duì)unigene進(jìn)行功能分類(lèi)和代謝通路分析，其中2877個(gè)unigene歸入45條代謝路徑。在參與黃芪生物活性物質(zhì)代謝的多糖代謝途徑中找到36條unigene，皂苷和黃酮相關(guān)的代謝途徑中找到68

5、條相關(guān)的unigene。
　　在黃芪轉(zhuǎn)錄組12880個(gè)轉(zhuǎn)錄本中發(fā)現(xiàn)1729個(gè)SSR位點(diǎn)，平均距離是7.97kb，包含了從單核苷酸類(lèi)型到六核苷酸的六種不同類(lèi)型，核心重復(fù)序列127種。黃芪基因組測(cè)序還沒(méi)有完成，然而可以利用全基因組測(cè)序的親緣關(guān)系較近大豆(Glycine max)、蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula）、百脈根（Lotus japonicus）的基因組序列作參考對(duì)黃芪（Astragalusmembranaceu

6、s）轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行基因模型預(yù)測(cè)分析。與蒺藜苜蓿比對(duì)上的基因數(shù)目是2039條，有21727個(gè)轉(zhuǎn)錄模型，堿基相似度是90.14％;和大豆比對(duì)上的基因數(shù)是1948條，有36864個(gè)轉(zhuǎn)錄模型，堿基相似度是90.40％;和百脈根比對(duì)上的基因數(shù)是1003條，有10056個(gè)轉(zhuǎn)錄模型，堿基相似度是89.77％。以蒺藜苜?；蚪M為參考預(yù)測(cè)的可變剪切位點(diǎn)是290種類(lèi)型，以大豆基因組為參考預(yù)測(cè)的可變剪切位點(diǎn)有284種類(lèi)型，以百脈根基因組為參考預(yù)測(cè)的可變剪切位點(diǎn)有