牛樟芝MVA途徑中基因克隆及轉錄組、代謝組研究.pdf

1、我國是食、藥用菌生產大國，牛樟芝（Antrodia cinnamomea）是我國臺灣著名藥用菌品種，富含三萜、腺苷、多糖等活性物質，具有增強免疫力、降血糖、抗過敏、保肝等多種功效。本課題對牛樟芝遺傳轉化體系構建、牛樟芝菌絲體液體發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化、牛樟芝MVA途徑中基因克隆和表達量以及牛樟芝子實體、菌絲體轉錄組和代謝組進行了研究，為進一步認識牛樟芝MVA途徑和相關代謝途徑中物質差異、解決牛樟芝工業(yè)生產瓶頸問題。主要結論如下：
　　第一

2、，牛樟芝菌絲體在固體和液體培養(yǎng)基中生長速度均呈先上升后下降的趨勢，在28℃，液體培養(yǎng)120 rpm·min，21~28 d時生物量達到最佳。收集生長14 d的新鮮牛樟芝菌絲體經10 mg·mL-1溶壁酶在30℃酶解4 h后，原生質體得率達3.55×105個·mL-1，且再生率達4.59％；20~40%PEG-CaCl2均可介導牛樟芝原生質體轉化，當40%PEG時轉化效率最高。用熒光顯微鏡和PCR對含GFP標記及潮霉素抗性的擬轉化子進行驗

3、證，結果證實該方法可將外源基因整合到牛樟芝基因組中。
　　第二，利用PB實驗、最陡爬坡實驗和RSM實驗篩選液體培養(yǎng)牛樟芝菌絲體生物量培養(yǎng)基和牛樟芝菌絲體富萜培養(yǎng)基。結果表明，實際生產中牛樟芝菌絲體生物量最適培養(yǎng)基為35.16 g·L-1葡萄糖，42.86 g·L-1麥芽糖，20.80 g·L-1酵母提取物，0.39 g·L-1VB1，0.85 g·L-1殼聚糖，當溫度為28℃，轉速為120 rpm·min-1，培養(yǎng)15 d后菌絲體

4、生物量為1.6765±0.0103 g·100 mL-1（DW）；篩選牛樟芝菌絲體富萜最適培養(yǎng)基為：10.32 g·L-1葡萄糖，42.58 g·L-1麥芽糖，15.37 g·L-1蛋白胨，1.12 g·L-1MgSO4，0.63 g·L-1KH2PO4，0.55 g·L-1菌草靈芝水提取物（JCGLWE），當溫度為28℃，轉速為120 rpm·min-1，培養(yǎng)15 d后菌絲體三萜含量為34.03±1.264 mg·g-1（DW）。

5、r>　　第三，利用簡并引物對牛樟芝的甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶（mvd）和鯊烯環(huán)氧酶（se）基因進行RACE擴增，gDNA全長分別為1268 bp和1607 bp，分別內含1個和3個內含子，cDNA序列分別編碼402氨基酸和481氨基酸，并對序列進行生物信息學分析。利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）分析不同形態(tài)及培養(yǎng)階段牛樟芝中mvd和se表達水平，結果表明培養(yǎng)7 d后菌絲體中mvd和se的表達量均達到最高，但隨著培養(yǎng)時間的延長而呈下降

6、趨勢，培養(yǎng)28~42 d后菌絲體中兩基因表達量趨于穩(wěn)定；菌絲體中三萜含量的測定結果表明，當培養(yǎng)時間小于28 d時，菌絲體中三萜含量隨著培養(yǎng)時間的延長而逐漸增加，且培養(yǎng)28 d時菌絲體的三萜含量最高，達39.192±2.025 mg·g-1，僅次于牛樟芝子實體三萜含量（49.391±2.675 mg·g-1），但菌絲體生長28 d后其三萜含量降低，玉米芯栽培的牛樟芝子實體三萜含量最低（為11.530±0.733 mg·g-1），各樣品與對

7、照組間三萜含量差異達到顯著水平。
　　第四，對牛樟芝子實體（樣品1號）、液體培養(yǎng)14 d牛樟芝菌絲體（樣品2號）和液體培養(yǎng)28 d牛樟芝菌絲體（樣品3號）的轉錄組GO及KEGG分析結果表明，基因表達差異分析結果顯示樣品1號與樣品2號間差異基因有324個，富集在83條GO-term中，其中307個為下調基因，17個為上調基因；樣品1號和樣品3號間差異基因有271個，富集在78條GO-term中，其中245個為下調基因，26個為上調基

8、因；樣品2號與樣品3號間存在的差異基因為337個，富集在46條GO-term中，其中244個為上調基因，93個為下調基因。KEGG結果表明子實體和菌絲體主要差異代謝途徑集中在碳代謝、氧化磷酸化、三羧酸循環(huán)、糖酵解、氨基酸生物合成等，而菌絲體間的差異代謝主要集中在脂肪酸代謝、NOD受體信號通路、PPAR信號通路等。結果說明不同形態(tài)牛樟芝間的碳代謝、氨基酸代謝發(fā)生了異常；而不同培養(yǎng)時間的菌絲體之間的脂肪酸代謝和各種信號通路發(fā)生了紊亂，其中以

9、脂肪酸代謝變化最為明顯。此外，從轉錄組測序結果中篩出2個較穩(wěn)定表達基因作為管家基因，并對三萜途徑中的差異基因驗證。
　　第五，對牛樟芝子實體（樣品1號）、液體培養(yǎng)14 d牛樟芝菌絲體（樣品2號）和液體培養(yǎng)28 d牛樟芝菌絲體（樣品3號）的代謝組分析結果表明，樣品1號與樣品2號中篩選出正負離子條件下已鑒定的代謝差異物分別為21種和26種；樣品1號與樣品3號中篩選出正負離子條件下已鑒定的代謝差異物分別為14種和28種；樣品2號與樣品3

10、號中篩選出正負離子條件下已鑒定的代謝差異物分別為20種和29種。子實體與菌絲體主要代謝差異途徑包括氨基酸合成代謝、碳代謝和糖代謝，兩者間的共同差異代謝物共47種；而菌絲體間主要代謝差異途徑包括氨基酸合成和脂肪酸代謝，兩者間差異代謝物共43種。研究發(fā)現，子實體與菌絲體間在負離子條件下特有潛在生物標記物有糞卟啉Ⅲ二鹽酸鹽（Coproporphyrin III）、NG,NG-二甲基-L-精氨酸（NG）、咪唑（Imidzaole）、乙酰基葡萄胺

11、脫氫酶（UDP-N-acetylglucosamine）、尿苷二磷酸葡萄糖（Uridine diphosphate glucose）、鳥氨酸（Ornithine）6種，不同培養(yǎng)時間菌絲體之間負離子條件下特有潛在生物標記物為 D-半乳糖，苷氨羧酸，β-D-果糖-2-磷酸鹽3種。
　　本文圍繞牛樟芝MVA途徑進行相關研究，通過液體發(fā)酵培養(yǎng)基篩選、基因克隆及表達、轉錄組和代謝組等方法綜合探討牛樟芝三萜類化合物合成途徑，研究結果為進一步挖