反義寡核苷酸陰離子脂質(zhì)體的制備及其對MRSA耐藥性的研究.pdf

1、目的：細菌耐藥性是近年來臨床中出現(xiàn)的常見問題，給感染的控制帶來了很大困難。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌是常見的一種耐藥菌，細菌一旦對甲氧西林耐藥，則所有β內(nèi)酰胺類抗生素都對其無效。因此，使耐甲氧西林金黃色葡萄球菌恢復對抗生素的敏感性十分重要。研究發(fā)現(xiàn)MRSA主要通過形成新的PBP2a和β-內(nèi)酰胺酶使β-內(nèi)酰胺類抗生素不能與之結(jié)合或水解而產(chǎn)生耐藥性。PBP2a和β-內(nèi)酰胺酶分別由mecA和blaZ基因編碼，其中mecA基因由MecRl/Mec

2、I調(diào)控，blaZ基因由BlaR1/BlaI調(diào)控。反義藥物可以選擇性地與靶基因特異結(jié)合，阻斷基因的表達從而發(fā)揮治療作用。因此考慮運用反義藥物特異阻斷耐藥基因表達通路從而逆轉(zhuǎn)細菌的耐藥性。反義藥物進入菌體需要借助載體的幫助，常見的載體有病毒載體和脂質(zhì)體等，陰離子脂質(zhì)體由于其毒性低，易降解，方便制備，免疫活性低等優(yōu)點被選取作為本實驗的反義藥物載體。本實驗以MecR1的mRNA為靶基因，合成反義寡核苷酸，以陰離子脂質(zhì)體為載體系統(tǒng)，制備反義寡核苷

3、酸陰離子脂質(zhì)體，對該脂質(zhì)體進行質(zhì)量評價，考察脂質(zhì)體將反義寡核苷酸轉(zhuǎn)進菌體內(nèi)的效率及轉(zhuǎn)運后反義寡核苷酸脂質(zhì)體對MRSA耐藥性的影響。 方法：1AS-ODNs脂質(zhì)體的制備：以MecR1mRNA為靶基因合成反義寡核苷酸W91087選用人工合成磷脂1,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-3-Phosphocholine和1,2-Dimyristoyl-sn-Glycero-[Phospho-rac-(1-glycerol)

4、]，采用薄膜分散凍干法制備AS-ODNs脂質(zhì)體；透射電鏡觀察脂質(zhì)體形態(tài)，離心純化脂質(zhì)體；紫外檢測脂質(zhì)體包封率，滲漏率；振蕩法測定釋放度。 2AS-ODNs脂質(zhì)體向MRSA轉(zhuǎn)運：將包裹FITC標記的反義寡核苷酸的脂質(zhì)體與MRSA混合，流式細胞儀檢測AS-ODNs脂質(zhì)體將藥物轉(zhuǎn)運進細菌的效率。 3AS-ODNs脂質(zhì)體逆轉(zhuǎn)MRSA耐藥性的研究：平板克隆形成實驗測定脂質(zhì)體對CFU的影響；測定AS-ODNs脂質(zhì)體對MRSA的生長曲

5、線的影響。 結(jié)果：1AS-ODNs脂質(zhì)體的制備：AS-ODNs陰離子脂質(zhì)體大小均勻，為圓球體，包封率為77.38％，冷凍條件下保存1個月后滲漏率為0.18％，體外釋放度實驗表明24h后約60％的藥物從脂質(zhì)體中釋放。 2AS-ODNs脂質(zhì)體向MRSA轉(zhuǎn)運：流式細胞儀結(jié)果顯示單純AS-ODNs組僅有3.9％的菌體內(nèi)有熒光信號，轉(zhuǎn)運效率很低，與之相比AS-ODNs脂質(zhì)體0.75,1.5,3mg/L組中分別有14％,17.6％，

6、22.6％的菌體內(nèi)有熒光信號，以上結(jié)果顯示AS-ODNs可以顯著提高AS-ODNs進入細菌的效率。 3AS-ODNs脂質(zhì)體逆轉(zhuǎn)MRSA耐藥性的研究：與空白組比較，AS-ODNs脂質(zhì)體能顯著抑制MRSA生長，脂質(zhì)體包裹的不同劑量的AS-ODNs中MRSA的CFU與空白對照組比較明顯減少(p＜0.05)，具有劑量依賴性，且效果明顯優(yōu)于未被脂質(zhì)體包裹的AS-ODNs(p＞0.05)。 結(jié)論：1AS-ODNs脂質(zhì)體易于制備，包封