聯(lián)合應(yīng)用反義Bcl-xl和反義Mcl-1寡核苷酸對惡性黑素瘤細胞多藥耐藥性影響的研究.pdf

1、目的：惡性黑素瘤是一種高度惡性的腫瘤，對臨床治療反應(yīng)不佳，預(yù)后差，死亡率高。而多藥耐藥是其臨床化療失敗的主要原因，因此，逆轉(zhuǎn)腫瘤的耐藥性是治療惡性黑素瘤的重要課題?，F(xiàn)有研究已證實凋亡及其調(diào)節(jié)因子是決定惡性黑素瘤耐藥的重要機制?？沟蛲龌虻倪^度表達使化療藥物不能發(fā)揮其誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的作用，致使惡性黑素瘤化療耐藥。其中以抗凋亡基因Bcl-2相關(guān)蛋白的作用尤為引人注目。Bcl-2基因家族促進凋亡基因和抑制凋亡基因之間的平衡決定細胞存活和凋亡

2、。Bcl-xl和Mcl-1基因都是Bcl-2家族中的抗凋亡基因，與細胞凋亡調(diào)節(jié)及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。近年國外研究發(fā)現(xiàn)，利用反義核酸下調(diào)Bcl-xl或Mcl-1基因的表達可以增加腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。我們前期工作也顯示Mcl-1反義寡核苷酸可部分逆轉(zhuǎn)惡性黑素瘤的耐藥性。但基于腫瘤是多基因多途徑共同作用的結(jié)果，腫瘤的耐藥性也可能涉及多個基因的改變。因此，設(shè)想聯(lián)合應(yīng)用Bel-2基因家族中具有抗凋亡作用基因的反義寡核苷酸，如針對Bc

3、l-xl和Mel-1的反義寡核苷酸，有可能更有效逆轉(zhuǎn)惡性黑素瘤的耐藥性。本實驗，通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的Bcl-xl和Mcl-1反義寡核苷酸聯(lián)合轉(zhuǎn)染惡性黑素瘤細胞WM451，觀察其誘導(dǎo)惡性黑素瘤細胞WM451凋亡及逆轉(zhuǎn)惡性黑素瘤化療耐藥的情況，旨在探討聯(lián)合應(yīng)用反義寡核苷酸逆轉(zhuǎn)惡性黑素瘤耐藥性的優(yōu)越性，為惡性黑素瘤的靶向聯(lián)合治療提供依據(jù)。 方法：利用陽離子脂質(zhì)體將Bcl-xl和Mcl-1反義核酸導(dǎo)入惡性黑素瘤細胞WM451；利用逆轉(zhuǎn)錄聚合

4、酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)的方法觀察轉(zhuǎn)染前后Bcl-xl及Mcl-1基因的表達情況；Western-blot法及免疫組化檢測腫瘤細胞轉(zhuǎn)染前后Bcl-xl及Mcl-1蛋白的表達情況；電鏡檢測轉(zhuǎn)染后凋亡細胞形態(tài)：流式細胞儀檢測細胞的凋亡率；MTT法檢測腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。 結(jié)果： 1 聯(lián)合轉(zhuǎn)染Bcl-xl和Mcl-1反義寡核苷酸后，Bcl-xl mRNA表達量和Mcl-1 mRNA的表達量均下降。 2 Wes

5、tern-blot檢測顯示聯(lián)合轉(zhuǎn)染Bcl-xl和Mcl-1反義寡核苷酸可下調(diào)Bcl-xl蛋白和Mcl-1蛋白水平。 3 聯(lián)合轉(zhuǎn)染Bcl-xl和Mcl-1反義寡核苷酸可顯著增加WM451細胞凋亡率，電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察顯示反義寡核苷酸組細胞呈現(xiàn)典型凋亡特征。 4 轉(zhuǎn)染Bcl-xl反義寡核苷酸組氮烯咪胺的IC50值從152.74ug/ml降至83.33 ug/ml；轉(zhuǎn)染Mcl.1反義寡核苷酸組氮烯咪胺的IC50值從152.74u

6、g/ml降至92.63 ug/ml；聯(lián)合轉(zhuǎn)染Bcl-xl和Mcl-1反義寡核苷酸組，氮烯咪胺的IC50值從152.74ug/ml降至64.34 ug/ml；結(jié)果表明Bcl-xl和Mcl-1反義寡核苷酸單獨或聯(lián)合均能增加WM451對氮烯咪胺的敏感性，而且與單獨轉(zhuǎn)染Bcl-xl或Mcl-1反義寡核苷酸組相比，聯(lián)合應(yīng)用Bcl-xl和Mcl-1反義寡核苷酸能更有效逆轉(zhuǎn)WM451細胞對DTIC的耐藥性(P<0.05)。 5 單獨轉(zhuǎn)染Bcl

7、-xl或Mcl-1反義寡核苷酸組與聯(lián)合應(yīng)用Bcl-xl和Mcl-1反義寡核苷酸組對順鉑IC50值的影響與正義，無義及對照組相比，無顯著性差異(P>0.05)。 結(jié)論： 1 Bcl-xl和/或Mcl-1反義寡核苷酸可通過下調(diào)Bcl-xl和/或Mcl-1表達而誘導(dǎo)WM451細胞凋亡。 2 Bcl-xl和Mcl-1反義寡核苷酸單獨或聯(lián)合應(yīng)用均可增加WM451細胞對氮烯咪胺的敏感性，部分逆轉(zhuǎn)惡性黑素瘤細胞的化療耐藥性，表