布氏白僵菌2382菌株及其代謝產(chǎn)物對(duì)油松毛蟲致病機(jī)理的研究.pdf

1、松毛蟲Dendrolimus spp.屬于鱗翅目Lepidoptera枯葉蛾科Lasiocampidae,它們分布廣,發(fā)生面積大,危害嚴(yán)重,是松林的重大害蟲。利用昆蟲病原真菌對(duì)松毛蟲進(jìn)行生物防治是實(shí)現(xiàn)其可持續(xù)控制的主要途徑,其中,白僵菌是應(yīng)用最廣泛的一類病原真菌。但是,由于白僵菌的萌發(fā)、生長(zhǎng)和侵染常需要較高的溫度和濕度,以往防治松毛蟲的菌種來(lái)源和應(yīng)用范圍主要局限在我國(guó)南方省份,北方低溫干旱的氣候條件對(duì)白僵菌的應(yīng)用造成困難。在白僵菌防治松

2、毛蟲上的另一個(gè)問(wèn)題是一些重要的致病機(jī)理還不清楚,特別是白僵菌侵染過(guò)程中次生代謝毒素對(duì)昆蟲的作用機(jī)制還缺乏研究。為了深入認(rèn)識(shí)白僵菌的致病機(jī)理,開(kāi)發(fā)適應(yīng)性強(qiáng)的高效致病菌株用于北方地區(qū)松毛蟲的生物防治,本文以我們2006年從河北承德油松林內(nèi)采集的自然感染死亡的油松毛蟲Dendrolimus tabulaeformis Tsai et Liu的蟲尸上分離得到的布氏白僵菌Beauveria brongniartii(Sacc.) Petch238

3、2菌株為試驗(yàn)材料,利用菌株對(duì)北方地區(qū)原寄生地的生態(tài)環(huán)境和宿主具有適應(yīng)性和遺傳保守性的特點(diǎn),開(kāi)展了系統(tǒng)研究。內(nèi)容包括:2382菌株的生物學(xué)特性研究、菌株次生代謝產(chǎn)物的分離純化和主要化學(xué)成分鑒定,以及菌株次生代謝毒素的粗提物和主要毒素成分對(duì)油松毛蟲幼蟲的毒性作用測(cè)定;菌株的孢子感染和次生代謝毒素作用對(duì)油松毛蟲幼蟲體內(nèi)兩種解毒酶活性的影響;菌株代謝毒素對(duì)油松毛蟲幼蟲血細(xì)胞凋亡的影響;菌株侵染對(duì)油松毛蟲幼蟲體內(nèi)糖代謝的影響。本研究為揭示白僵菌感

4、染對(duì)油松毛蟲的致病機(jī)理提供了新證據(jù)。本研究主要內(nèi)容包括：
　?、?382菌株的生物學(xué)特性。測(cè)定了不同溫度和濕度對(duì)菌落生長(zhǎng)、孢子產(chǎn)量和孢子萌發(fā)率的影響。結(jié)果顯示,2382菌株在25±1℃下菌落生長(zhǎng)速率為(0.82±0.03) cm/d,顯著高于其他溫度條件(P<0.05),說(shuō)明25±1℃為該菌株的最適菌落生長(zhǎng)溫度;在15±1℃、20±1℃、25±1℃三個(gè)溫度條件下,產(chǎn)孢量分別是(4.89±0.19)×108孢子/cm2、(4.30±

5、0.16)×108孢子/cm2、(3.72±0.56)×108孢子/cm2,顯著高于30±1℃時(shí)的產(chǎn)孢量(3.18±0.21)×108孢子/cm2(P<0.05),說(shuō)明該菌株的適合產(chǎn)孢溫度范圍在15±1℃-25±1℃;在25±1℃時(shí),相對(duì)濕度分別為30±10％、50±10%、70±10%時(shí),孢子萌發(fā)率分別為(8.03±0.25)%,(51.63±1.12)%,(93.10±2.25)%,說(shuō)明相對(duì)濕度對(duì)該菌株孢子萌發(fā)影響較大。由以上結(jié)果表

6、明2382菌株對(duì)溫濕度有較寬的適應(yīng)范圍,有利于在林間溫濕度變化較大的北方松林環(huán)境中存活和侵染,是在北方地區(qū)開(kāi)展油松毛蟲防治應(yīng)用的一個(gè)潛在優(yōu)良菌種。
　?、?382菌株次生代謝產(chǎn)物的分離純化、主要化學(xué)成分鑒定及其對(duì)油松毛蟲的毒性作用。采用液體培養(yǎng),得到2382菌株的發(fā)酵液,對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行離心、濃縮、醇沉和萃取,得到該菌株次生代謝產(chǎn)物粗提物為深紅色粉末。用該粗提物對(duì)油松毛蟲4齡幼蟲進(jìn)行染毒試驗(yàn),其結(jié)果證明粗提物具有殺蟲活性,半致死濃度為

7、2.8×102μg/mL;采用硅膠柱層析對(duì)毒素粗提物進(jìn)行分離得到6組物質(zhì),其中第6組物質(zhì)的含量最大。用第6組物質(zhì)(55μg/mL)對(duì)油松毛蟲4齡幼蟲作染毒試驗(yàn),油松毛蟲的校正死亡率為(60.15±3.41)%;利用GC/MS聯(lián)用技術(shù),對(duì)第6組物質(zhì)進(jìn)行化學(xué)成分分析,顯示其包括17個(gè)組分,其中相對(duì)含量大于10%的有3種,即2-哌啶酮(占14.02%)、2-香豆?jié)M酮(占47.10%)、六氫化-吡咯環(huán)[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮(占21.0

8、5%);用2-哌啶酮和2-香豆?jié)M酮(濃度為55μg/mL)分別對(duì)油松毛蟲5齡幼蟲作殺蟲試驗(yàn),校正死亡率分別為(67.83±1.52)%和(82.61±2.65)%。由此可知,2-哌啶酮和2-香豆?jié)M酮是該菌株的主要代謝毒素物質(zhì)。該研究為白僵菌對(duì)油松毛蟲致病機(jī)理方面的研究提供了新的理論依據(jù)。
　?、?382菌株及其代謝毒素對(duì)油松毛蟲體內(nèi)兩種解毒酶谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)和酯酶(EST)活性的影響。用菌株孢子懸液(濃度為6×105、

9、6×106、6×107孢子/L)和菌株次生代謝毒素(濃度為5.5、55、550μg/mL)處理油松毛蟲幼蟲,測(cè)定蟲體內(nèi)GST和EST活性的變化。結(jié)果顯示：用菌株孢子懸液和次生代謝毒素處理后,都能引起油松毛蟲體內(nèi)GST和EST活性升高。其中用孢子懸液處理后,蟲體內(nèi)GST活性在第3 d達(dá)到最大值,在濃度為6×106孢子/mL和6×107孢子/mL兩個(gè)處理組的酶活性分別為0.050±0.010(μmol/min/mg protein)、0.1

10、84±0.013(μmol/min/mg protein),顯著高于對(duì)照組的酶活0.032±0.004(μmol/min/mg protein)。以α-naphthyl acetate為底物時(shí),蟲體內(nèi)EST活性在處理后的第3 d達(dá)到最大值,分別為0.159±0.003(μmol/min/mg protein)、0.184±0.005(μmol/min/mg protein)、0.237±0.009(μmol/min/mg protein

11、),且3個(gè)濃度之間酶活的差異達(dá)到顯著水平。以β-naphthyl acetate為底物時(shí),蟲體內(nèi)EST活性出現(xiàn)了與以α-naphthyl acetate為底物時(shí)相似的變化趨勢(shì),在處理后的第3 d達(dá)到最大值,分別為0.214±0.006(μmol/min/mg protein)、0.227±0.001(μmol/min/mg protein)、0.266±0.005(μmol/min/mg protein)；用3個(gè)濃度的菌株次生代謝毒素處

12、理后,蟲體內(nèi)GST活性在6 h達(dá)到最大值,分別為0.497±0.012(μmol/min/mg protein)、0.652±0.014(μmol/min/mg protein)、0.944±0.030(μmol/min/mg protein),且各時(shí)間點(diǎn)(2、4、6、12、24、48 h)之間和各濃度之間酶活的差異達(dá)到顯著水平。以α-naphthyl acetate為底物時(shí),蟲體內(nèi)EST活性在處理后的24 h達(dá)到最大值,分別為54.3

13、1±3.20(μmol/min/mg protein)、90.42±4.33(μmol/min/mg protein)、106.98±5.32(μmol/min/mg protein),且3個(gè)濃度之間酶活差異達(dá)到顯著水平。以β-naphthyl acetate為底物時(shí),蟲體內(nèi)EST活性出現(xiàn)了與以α-naphthyl acetate為底物時(shí)相似的變化趨勢(shì),在處理后的24 h達(dá)到最大值,分別為11.96±0.42(μmol/min/mg p

14、rotein)、12.05±0.47(μmol/min/mg protein)、16.98±0.74(μmol/min/mg protein)。該研究結(jié)果表明,白僵菌2382菌株的孢子懸液和次生代謝毒素對(duì)油松毛蟲都具有毒性作用,在白僵菌感染油松毛蟲過(guò)程中,蟲體內(nèi)GST和EST是白僵菌的攻擊靶標(biāo),菌株及其次生代謝毒素打破了油松毛蟲體內(nèi)解毒酶的免疫機(jī)制,導(dǎo)致寄主死亡。該研究首次為白僵菌次生代謝毒素作用于油松毛蟲免疫系統(tǒng)的兩種解毒酶提供了新的

15、依據(jù)。
　?、?382菌株次生代謝毒素對(duì)油松毛蟲幼蟲血細(xì)胞凋亡的影響。用2382菌株的次生代謝毒素(濃度5.5、55、550μg/mL)對(duì)油松毛蟲4齡幼蟲染毒處理,用熒光顯微鏡、透射電鏡、流式細(xì)胞儀對(duì)幼蟲血細(xì)胞的凋亡癥狀和凋亡率進(jìn)行觀察和檢測(cè)。熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示,在染毒處理后的6 h,大部分血細(xì)胞處于早期凋亡階段,發(fā)出均勻的黃綠色熒光。在處理后的12 h,血細(xì)胞大部分處于晚期凋亡階段,發(fā)出不均勻的桔紅色熒光。在對(duì)照組,幼蟲的血

16、細(xì)胞大部分為正常細(xì)胞,發(fā)出均勻的綠色熒光；用透射顯微鏡觀察幼蟲血細(xì)胞超微結(jié)構(gòu),結(jié)果顯示,在處理組中,幼蟲血細(xì)胞凋亡的病理學(xué)癥狀表現(xiàn)為細(xì)胞核皺縮,核膜有輕微褶皺,染色質(zhì)發(fā)生凝集,線粒體內(nèi)的嵴排列紊亂或消失,細(xì)胞質(zhì)中產(chǎn)生氣泡和纖維化凝集；用流式細(xì)胞儀檢測(cè)幼蟲血細(xì)胞凋亡率,結(jié)果顯示,在處理后的6 h,用3個(gè)濃度的次生代謝物處理組,幼蟲血細(xì)胞早期凋亡率分別為11.93%、13.10%、18.42%。血細(xì)胞晚期凋亡出現(xiàn)在處理后的12 h、24 h

17、、36 h。其中在用濃度為55μg/mL的處理組,處理24 h后出現(xiàn)了最大凋亡率為(36.54±4.37)%。血細(xì)胞凋亡率與次生代謝毒素的濃度與作用時(shí)間具有相關(guān)性。用三種不同的技術(shù)手段和方法,揭示了2382菌株次生代謝毒素能夠攻擊油松毛蟲幼蟲血細(xì)胞并誘導(dǎo)其凋亡。為病原真菌在感染宿主昆蟲過(guò)程中,能以次生代謝毒素作用于宿主的血細(xì)胞免疫功能,提供了新的證據(jù)。
　?、?382菌株侵染油松毛蟲幼蟲后蟲體內(nèi)糖代謝的變化。為了揭示病原真菌白僵菌

18、侵染昆蟲過(guò)程中如何轉(zhuǎn)化和利用蟲體內(nèi)糖類物質(zhì)作為自身營(yíng)養(yǎng),本研究測(cè)定了2382菌株感染油松毛蟲幼蟲后,蟲體血淋巴中酸性海藻糖降解酶活性及海藻糖和葡萄糖含量的變化。結(jié)果顯示,油松毛蟲4齡幼蟲感染菌株孢子懸浮液后,血淋巴中酸性海藻糖降解酶的活性明顯高于對(duì)照組,感染后第3d酶活性達(dá)到最大值為(0.2786±0.0446) U/mg,此后第4-6 d酶活性逐漸降低;染菌后的6d中,血淋巴中海藻糖含量顯著低于對(duì)照組,同樣在感染后第4d其含量逐漸降低

19、,第6d時(shí)降到最低值。相比之下,處理組血淋巴中的葡萄糖含量顯著高于對(duì)照組,其含量在第1-3 d內(nèi)呈現(xiàn)快速升高趨勢(shì),在第3 d達(dá)到最大值為(7.7615±0.4040) mmol/L,然后逐漸降低。由此說(shuō)明,2382菌株侵入油松毛蟲血淋巴后,菌株代謝產(chǎn)生酸性海藻糖降解酶,將血淋巴中的海藻糖水解成為葡萄糖,然后為真菌利用,破壞了蟲體內(nèi)的血糖平衡,這是一個(gè)相互連接的生理代謝和生化反應(yīng)過(guò)程。該研究為白僵菌感染油松毛蟲過(guò)程中蟲體內(nèi)糖類轉(zhuǎn)化提供了新

20、的證據(jù)。
　?、恃芯恳后w培養(yǎng)條件對(duì)該菌株代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的影響。采用正交試驗(yàn)(4因子3水平)的方法,研究了培養(yǎng)條件對(duì)該菌株液體擴(kuò)大培養(yǎng)產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的影響。結(jié)果顯示,4個(gè)試驗(yàn)因子中對(duì)代謝毒素產(chǎn)量影響的強(qiáng)弱順序依次為培養(yǎng)基初始pH值(B)>培養(yǎng)時(shí)間(A)>培養(yǎng)溫度(D)>轉(zhuǎn)速(C)。在4因子3水平的試驗(yàn)中,菌株產(chǎn)生代謝毒素的最佳培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)10 d、培養(yǎng)基初始pH值5.0、轉(zhuǎn)速140 r/min、30℃(A2B1C2D3)。此研究對(duì)大