食源性致病沙門氏菌特征性代謝產(chǎn)物研究.pdf

1、沙門氏菌細(xì)菌是與動(dòng)物和人類感染相關(guān)聯(lián)的一類極為重要的食源性腸道致病菌，全球每年發(fā)生食源性致病菌感染事故很多，其中沙門氏菌感染事件更是位居世界前列。隨著污染樣品數(shù)量的增多，檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)、效率低的傳統(tǒng)微生物檢測(cè)手段，對(duì)特異性抗體高要求的免疫學(xué)方法以及易產(chǎn)生假陽性現(xiàn)象的PCR檢測(cè)技術(shù)，已不能滿足現(xiàn)代食源性致病菌高效快速的檢測(cè)要求，因此建立科學(xué)、全面、快速、精準(zhǔn)的食源性致病微生物檢測(cè)體系，預(yù)防、控制食源性致病菌感染事故發(fā)生，保障食品安全，已經(jīng)成為

2、全世界公共衛(wèi)生安全最關(guān)注的問題之一。
　　本論文主要從優(yōu)化常見食源性致病腸炎沙門氏菌代謝組學(xué)提取試劑前處理方法出發(fā)，較系統(tǒng)的研究5種不同血清型沙門氏菌的代謝輪廓，結(jié)合指紋圖譜和PCA主成分分析，研究各種血清型代謝產(chǎn)物之間的差異性和相似性以及各種血清型的潛在生物標(biāo)志物，從而對(duì)不同血清型進(jìn)行區(qū)分鑒別。為了探討血清型特征性產(chǎn)物的可信度和科學(xué)性，對(duì)同血清型標(biāo)準(zhǔn)菌株和分離株的胞內(nèi)產(chǎn)物進(jìn)行對(duì)比研究，探討兩者之間的關(guān)聯(lián)，為DNA高度同源性以及復(fù)

3、雜多樣的的沙門氏菌血清型鑒別提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。具體研究?jī)?nèi)容和結(jié)果研究如下:
　　1、通過優(yōu)化腸炎沙門氏菌ATCC13076胞內(nèi)代謝產(chǎn)物前處理方法，得到最佳的產(chǎn)物提取混合試劑比例為CH3OH/CH2Cl2/H2O（-40℃、90％）=3∶1∶1,可以作為后續(xù)的提取方法。
　　2、采用GC-MS對(duì)5種沙門氏菌血清型標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行胞內(nèi)代謝提取，共檢索出127種胞內(nèi)代謝產(chǎn)物。通過構(gòu)建指紋圖譜進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)腸炎沙門氏菌血清型(1,9,

4、12∶g，m∶[1,7])特有的生物標(biāo)志物為硫基乙酸和α-羥基-戊二酸;傷寒沙門氏菌血清型（9,12,vi∶d∶_）特有的產(chǎn)物為N-乙?；?天冬氨酸、2(1H)-嘧啶酮和L-蘇糖酸;鼠傷寒沙門氏菌血清型(1,4,[5]，12∶i∶1,2)特有的產(chǎn)物為肉豆蔻酸甲酯和甘油醚葡萄糖苷;亞利桑那沙門氏菌血清型(1,2∶1,2,5)特有的產(chǎn)物為3-吡啶甲酸三甲酯;豬霍亂沙門氏菌血清型(6,7∶c∶1,5)特有的產(chǎn)物為1,4-萘醌。通過聚類分析和兩

5、步主成分分析表明，可以明顯區(qū)分這5種血清型。結(jié)果表明，基于代謝組學(xué)技術(shù)建立胞內(nèi)代謝產(chǎn)物指紋圖譜和特征性生物標(biāo)志物可以明顯區(qū)分不同的血清型。
　　3、采用GC-MS對(duì)1株腸炎沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和5株來源不同區(qū)域的同血清型分離株進(jìn)行胞內(nèi)代謝提取，共檢索出137種胞內(nèi)代謝產(chǎn)物。對(duì)6株樣品提取出的所有胞內(nèi)代謝產(chǎn)物進(jìn)行代謝輪廓分析，發(fā)現(xiàn)各類產(chǎn)物在種類和豐度上雖然具有一定的差異性，但總體上相似度很高。通過對(duì)指紋圖譜進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)特異性產(chǎn)物硫基乙

6、酸和α-羥基戊二酸均存在于5株分離株中。進(jìn)一步通過PCA主成分分析，發(fā)現(xiàn)6株菌株可以分為一大類群。結(jié)果可以初步驗(yàn)證特異性產(chǎn)物硫基乙酸和α-羥基戊二酸有望成為腸炎沙門氏菌血清型(1,9,12∶g，m∶[1,7])的新特征性生物標(biāo)志物;進(jìn)一步表明，本文采用的代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)沙門氏菌胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的提取具有很高的重現(xiàn)性和科學(xué)性。
　　4、采用GC-MS對(duì)1株鼠傷寒沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和5株來源不同區(qū)域的同血清型分離株進(jìn)行胞內(nèi)代謝提取，共檢索出1

7、55種胞內(nèi)代謝產(chǎn)物。對(duì)6株樣品提取出的所有代謝產(chǎn)物進(jìn)行代謝輪廓分析，發(fā)現(xiàn)各類產(chǎn)物在種類和豐度上雖然具有一定的差異性，但總體上相似度很高。通過對(duì)指紋圖譜進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)特異性產(chǎn)物肉豆蔻酸甲酯和甘油醚葡萄糖苷均存在于5株分離株中，通過PCA主成分分析，發(fā)現(xiàn)6株菌株可以分為一大類群。結(jié)果可以初步證明特異性產(chǎn)物肉豆蔻酸甲酯和甘油醚葡萄糖苷有望成為鼠傷寒沙門氏菌血清型(1,4,[5]，12∶i∶1,2)的新特征性生物標(biāo)志物;可以進(jìn)一步證明基于代謝組

8、學(xué)技術(shù)對(duì)沙門氏菌胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的提取具有很高的重現(xiàn)性。
　　綜上所述，本論文優(yōu)化了食源性致病沙門氏菌代謝組學(xué)前處理方法，研究了各實(shí)驗(yàn)菌株的代謝輪廓，并構(gòu)建指紋圖譜，尋找到了潛在的生物標(biāo)志物，結(jié)合聚類分析和PCA對(duì)不同血清型進(jìn)行區(qū)分鑒別，并探討同血清型標(biāo)準(zhǔn)菌和分離株之間的關(guān)聯(lián)。為食源性致病沙門氏菌建立健全、全面、快速、精準(zhǔn)的檢測(cè)方法提供了實(shí)驗(yàn)方法和數(shù)據(jù)支撐。由于目前發(fā)現(xiàn)的沙門氏菌血清型多達(dá)2500多種，我國(guó)也檢測(cè)達(dá)200多種，基于代謝