Exendin-4對大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元缺血再灌注損傷后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、研究背景和目的:Exendin-4是一種從美洲希拉毒蜥（Heloderma Suspectum）唾液中提取的胰高血糖素樣肽-1 （GLP-1）類似物，已于 2005年經(jīng)美國食品藥物管理局（FDA）認(rèn)證獲準(zhǔn)用于 2 型糖尿病患者的臨床治療。與 GLP-1相比，Exendin-4 具有半衰期長、與受體結(jié)合親和力高、易通過血腦屏障等多種優(yōu)勢。其與胰島β細(xì)胞膜上的GLP-1 受體（GLP-1R）特異性結(jié)合后可介導(dǎo)血糖依賴性降糖、促進(jìn)細(xì)胞生存等多

2、種生物學(xué)效應(yīng)。GLP-1R在中樞及周圍神經(jīng)系統(tǒng)中的廣泛分布，為 Exendin-4在神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療中的應(yīng)用提供了初步的理論基礎(chǔ)。近年來的研究表明，GLP-1R 激活后可促進(jìn)細(xì)胞增殖分化、增強(qiáng)突觸可塑性、抑制食欲、減輕體重、改善脂質(zhì)代謝等。由此，Exendin-4的神經(jīng)保護(hù)特性也日益受到人們的關(guān)注。目前 Exendin-4的研究領(lǐng)域主要集中于神經(jīng)退行性疾病，而其與腦血管病的相關(guān)性研究則相對較少。神經(jīng)元及胰島β細(xì)胞均具有高度發(fā)達(dá)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，

3、對 ER 內(nèi)穩(wěn)態(tài)紊亂極為敏感。多種病理改變均可破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能，進(jìn)而觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ESR）及未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）。這種細(xì)胞自我保護(hù)機(jī)制同時存在于糖尿病、腦梗死，并參與了疾病的發(fā)生發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，Exendin-4與胰島β細(xì)胞膜上的GLP-1R 特異性結(jié)合后可激活 cAMP/PKA 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性細(xì)胞凋亡。由此可以推測Exendin-4的抗凋亡機(jī)制可能同樣適用于腦缺血再灌注損傷。如能深入探討其相關(guān)機(jī)制，可為缺血性腦血管

4、病的防治提供新思路。本研究旨在以原代培養(yǎng)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元建立氧糖剝奪/復(fù)供（OGD/R）離體模型模擬體外神經(jīng)元缺血再灌注（I/R）損傷，觀察 Exendin-4 對體外模擬缺血再灌注后大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元 ESR 相關(guān)基因表達(dá)的影響，并探討其可能機(jī)制。
　　 方法:體外培養(yǎng)Sprague Dawley 乳鼠皮質(zhì)神經(jīng)元，隨機(jī)分為對照組、模型組、治療組，按照 MTT 檢測結(jié)果篩選出的最低有效濃度給藥。治療組于建模前 2 h、建模中均給予

5、Exendin-4 ；模型組于體外模擬缺血再灌注損傷（氧糖剝奪/復(fù)供，OGD/R）并給予等體積三蒸水；對照組始終正常培養(yǎng)。免疫熒光染色鑒定神經(jīng)元純度，RT-PCR檢測GLP-1R mRNA表達(dá)，ELISA 法檢測神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)cAMP 水平，MTT 法測定神經(jīng)元存活率，Hoechest 33258 熒光染色及流式細(xì)胞術(shù) AnnexinV、PI 雙標(biāo)法檢測神經(jīng)元凋亡率，real-time PCR檢測C/EBP 同源蛋白（CHOP）、生長抑制

6、和 DNA損傷基因34 （GADD34）基因表達(dá)，免疫熒光及 Western-blot 免疫印跡法檢測葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78 （GRP78）、CHOP 蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1.Hoechest 33258 檢測結(jié)果顯示，模型組神經(jīng)元凋亡率較對照組明顯增加，并隨復(fù)供時間的延長而呈上升趨勢，鏡下可見細(xì)胞凋亡發(fā)生的形態(tài)學(xué)改變（細(xì)胞核呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染，熒光著色強(qiáng)）；
　　 2.RT-PCR檢測結(jié)果顯

7、示，原代大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元中 GLP-1R基因呈陽性表達(dá)；
　　 3.ELISA 檢測結(jié)果顯示，0.3 μg/ml Exendin-4 作用后，神經(jīng)元內(nèi) cAMP 含量迅速增加，15min 達(dá)峰值，30 min 降至基線水平；
　　 4.MTT 結(jié)果顯示，模型組神經(jīng)元存活率較對照組明顯下降，Exendin-4 干預(yù)后神經(jīng)元存活率提高，在0.2 ~ 0.8 μg/ml 濃度范圍內(nèi)呈劑量依賴性；
　　 5.Hoeches

8、t 33258 法及流式細(xì)胞術(shù) Annexin V、PI 雙標(biāo)法檢測結(jié)果均顯示，ODG/R 12 h 時治療組（0.4 μg/ml）細(xì)胞凋亡率明顯低于模型組；
　　 6.免疫熒光及 Western-blot 免疫印跡結(jié)果均顯示，ODG/R 12 h時模型組 GRP78、CHOP 蛋白表達(dá)增加（尤以CHOP 為著），Exendin-4 （0.4 μg/ml）干預(yù)后 GRP78表達(dá)進(jìn)一步增加，CHOP表達(dá)則降低；
　　 7.

9、real-time PCR檢測結(jié)果顯示，模型組 CHOP mRNA、GADD34 mRNA 含量隨復(fù)供時間延長呈上升趨勢，治療組（0.4 μg/ml）CHOP mRNA、GADD34 mRNA表達(dá)于復(fù)供早期即迅速上升，ODG/R 8 h 達(dá)峰值，后期下降；
　　 8.Western-blot 免疫印跡分析結(jié)果均顯示，模型組GRP78、CHOP 蛋白表達(dá)隨復(fù)供時間延長呈上升趨勢，治療組（0.4 μg/ml）GRP78 蛋白表達(dá)進(jìn)一

10、步增加（各時間點(diǎn)均高于模型組），CHOP 蛋白表2?華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文達(dá)則在復(fù)供早期迅速上升，達(dá)峰值后降至模型組水平以下。
　　 結(jié)論:
　　 1.體外模擬缺血再灌注（OGD/R）損傷可誘導(dǎo)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元發(fā)生細(xì)胞凋亡；
　　 2.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡通路是缺血再灌注損傷后神經(jīng)元死亡的病理機(jī)制之一；
　　 3.Exendin-4 可緩和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，進(jìn)而抑制損傷后神經(jīng)元凋亡的發(fā)生；
　　 4.Exendi