EGb761對腦缺血再灌注后大鼠中腦膠質細胞和多巴胺神經元的影響.pdf

1、目的:
　　 缺血性腦血管病是嚴重危害人類健康的常見病、多發(fā)病之一，具有高發(fā)病率、高致殘率、高致死率的特點。目前關于缺血性腦血管病的研究主要集中在缺血梗死灶的局部，而對與缺血梗死相關聯的腦組織、細胞的損傷研究較少。近年來，有研究表明，腦梗死治療效果差的原因不僅與梗死灶局部神經元死亡密切相關，與遠隔部位損傷也有著不容忽視的作用，且可能影響腦梗死的預后。
　　 膠質源性纖維酸性蛋白（glial fibrillary acid

2、ic protein，GFAP）是星形膠質細胞的一種主要中間纖維蛋白，被作為星形膠質細胞成熟活化的標志蛋白，其表達數目增加一定程度上反映了腦組織受損的程度。酪氨酸羥化酶(Tyrosine of enzyme，TH)在中腦的黑質致密部分布密度最高，被用來標志腦內多巴胺能神經元，TH活性的下降，DA合成減少，進而DA能神經元細胞變性、壞死，還增加細胞外源性毒物的敏感性，加重腦組織損害。因此，黑質內TH陽性細胞計數可以間接反映DA能神經元功能

3、的變化。
　　 標準銀杏葉提取物(Ginkgo biloba extract，EGb761)，主要含24％的銀杏黃酮苷(flavonoid)和6％的萜烯內酯(terpenoid)等多種活性物質。EGb761在腦缺血時對神經元保護作用的研究較多，而其對神經膠質細胞抗缺血損傷作用的研究卻很少受到關注，其對遠隔部位損傷方面的保護作用及其機制尚不清楚。
　　 本研究通過建立大鼠大腦中動脈內栓線阻斷法(MCAO)腦梗死模型，探討急

4、性腦缺血再灌注后大鼠中腦黑質部位星形膠質細胞、多巴胺能神經元、細胞凋亡的變化及EGb761的干預作用，為臨床治療提供理論依據。
　　 材料與方法:
　　 1.實驗動物與分組：清潔級健康雄性SD大鼠54只，體重220±30g，隨機分為三組：假手術組，模型組，EGb761干預組，每組18只，每組再分為三個不同時間點1天、3天、7天，每個時間點6只大鼠。
　　 2.模型的制作：參照Longa的大鼠大腦中動脈內栓線阻斷法

5、(MCAO)適當改良后進行。建立大腦中動脈缺血再灌注模型，假手木組除不插線外，余步驟同其它兩組。術后觀察同側Horner氏征及對側肢體癱瘓體征來判斷模型是否成功。
　　 3.動物給藥方法：將標準銀杏葉提取物(EGb761)金納多片研成粉末狀，用蒸餾水溶解并混勻配成濃度為5mg/ml的溶液，術后24小時按照0.5ml/100g灌胃，假手術組和模型組給予等量生理鹽水灌胃。各組灌胃均每日一次，直至處死。
　　 4.標本的收集與

6、處理：模型制作成功后大鼠分別于1d、3d、7d時，10％水合氯醛(2.5ml/kg)麻醉下，心臟灌注，斷頭取腦，固定后制作石蠟切片，供HE染色、免疫組化染色、TUNEL檢測用。
　　 5.觀察指標：(1)HE染色觀察腦組織病理變化；(2)免疫組化染色檢測大鼠腦組織梗死后中腦黑質部位GFAP、TH免疫染色陽性細胞數的表達情況；(3)TUNEL檢測細胞凋亡情況。
　　 6.統(tǒng)計方法：實驗數據用均數±標準差（(x-)±s）表示

7、，應用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。以α=0.05作為顯著性檢驗水準。
　　 結果:
　　 1.HE染色：假手術組中腦黑質細胞結構緊密，層次清晰，神經元偶見變性、壞死，大部分細胞形態(tài)正常未見明顯的病理變化；模型組細胞排列稀疏，結構紊亂，神經元數目明顯減少，可見大量變性、壞死的神經元，可見胞核皺縮、碎斤出現，細胞周圍有間隙，空泡變性；EGb761干預組神經細胞的結構破壞及神經元變性、壞死較模型組明顯減輕。
　

8、　 2.GFAP免疫組化染色：各組取同側黑質部位進行觀察，計數GFAP免疫染色陽性細胞個數進行統(tǒng)計分析。假手術組GFAP陽性細胞數有少量表達，各組間差別無顯著意義。1d、3d、7d時GFAP陽性細胞表達，模型組分別為12.17±2.04:19.00±1.78、25.33±2.12;干預組：10.00±1.41、14.33±2.73、17.16±1.47。模型組各時間點GFAP陽性細胞數均明顯多于假手術組和干預組，7d時陽性細胞數較1d

9、、3d多，差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　 3.細胞凋亡的檢測：TUNEL檢測細胞凋亡陽性數目，假手術組各時間點未見陽性細胞。1d、3d、7d時陽性細胞數，模型組：12.23±4.97、39.40±6.94、26.18±6.53；干預組：7.31±1.92、20.26±4.61、12.23±3.70。模型組和干預組均有大量凋亡陽性細胞，且均3d時最多，干預組較模型組明顯減少，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

10、　　 4.TH免疫組化：TH為胞質和胞膜著色，陽性細胞顯示深棕黃色或深褐色。1d、3d、7d時各組陽性細胞數分別為：假手術組23.39±1.14、24.87±1.98、23.79±2.23；模型組11.67±1.36、8.87±2.43、6.15±1.09：干預組18.68±1.29、14.38±0.71、10.17±1.82。與假手術組比較，缺血再灌注后各時間點，中腦黑質TH陽性細胞表達減少，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，干預組