絕經(jīng)后壓力性尿失禁婦女尿道旁陰道前壁組織microRNA表達(dá)譜及其靶標(biāo)分析.pdf

1、microRNA(miRNA)是一類約22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA,廣泛存在于動(dòng)植物細(xì)胞中,是一種新型的基因表達(dá)調(diào)控因子,負(fù)向調(diào)控靶基因(mRNA)表達(dá),是近幾年生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。miRNA通過(guò)調(diào)節(jié)目的靶基因的表達(dá),在生物體發(fā)育、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞增殖、凋亡等生理和病理過(guò)程中均發(fā)揮重要作用。應(yīng)用芯片技術(shù)篩查miRNA表達(dá)譜、驗(yàn)證及鑒定其靶基因以及進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能的實(shí)驗(yàn)方法得到廣泛應(yīng)用。探索miRNA在基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的

2、功能,揭示其在疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的重要角色,為miRNA在疾病基因診斷、治療的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。
　　 壓力性尿失禁(stress urinary incontinence,SUI)屬于盆底功能障礙性疾患(pelvic floor dysfunction,PFD),是困擾中老年女性健康的普遍問(wèn)題,是涉及社會(huì)學(xué)和衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)學(xué)的健康問(wèn)題。大量流行病學(xué)研究顯示絕經(jīng)是SUI發(fā)病的重要高危因素。目前SUI在流行病學(xué)調(diào)查、解剖改變、臨床

3、特性以及組織化學(xué)方面的研究取得了一定進(jìn)展,然而這些多為疾病表觀、形態(tài)學(xué)上的研究,尚無(wú)哪種分子機(jī)制得到深入探索并被廣泛接受。多項(xiàng)設(shè)計(jì)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)碾p胞胎問(wèn)卷調(diào)查研究強(qiáng)調(diào)了“內(nèi)在的、遺傳性”因素在SUI發(fā)生發(fā)展中的作用。我們課題組前期研究運(yùn)用人類全基因組表達(dá)譜芯片篩選出75個(gè)在絕經(jīng)后SUI組與正常對(duì)照組之間差異表達(dá)的基因,其中31個(gè)基因表達(dá)上調(diào),44個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western Blot驗(yàn)證了目標(biāo)差異基因在SUI組的表達(dá)變化趨

4、勢(shì)與芯片一致,佐證了芯片結(jié)果的可信性,同時(shí)分析了其功能蛋白的作用,認(rèn)為神經(jīng)損傷變性通路的基因表達(dá)產(chǎn)物參與了SUI的發(fā)生發(fā)展。
　　 迄今為止,國(guó)內(nèi)外尚無(wú)microRNA在女性盆底功能障礙性疾病中的研究報(bào)道。本研究即從microRNA的角度,進(jìn)一步探討絕經(jīng)后SUI發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制。
　　 陰道前壁提供尿道與膀胱頸部以穩(wěn)定的基石作用,阻止腹壓增加時(shí)尿道及膀胱頸部的下移,其組織成分的改變導(dǎo)致機(jī)械穩(wěn)定性的減弱,對(duì)于SUI病理生

5、理學(xué)發(fā)生發(fā)展機(jī)制至關(guān)重要。所以本研究選擇尿道與膀胱連接處相當(dāng)于膀胱頸部的陰道前壁組織作為實(shí)驗(yàn)標(biāo)本。
　　 ●研究目的
　　 通過(guò)芯片技術(shù)檢測(cè)microRNA在絕經(jīng)后SUI組與正常對(duì)照組尿道旁陰道前壁組織的差異表達(dá),結(jié)合本課題組前期基因芯片研究結(jié)果以及microRNA靶基因數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行交叉比對(duì)、雙向預(yù)測(cè)篩選,并行進(jìn)一步的驗(yàn)證,從而初步構(gòu)建絕經(jīng)后SUI“microRNA-靶基因-蛋白質(zhì)”相互調(diào)控的分子網(wǎng)絡(luò)。從microRNA的

6、角度,進(jìn)一步探討絕經(jīng)后SUI發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制。
　　 ●研究方法
　　 1.在年齡、產(chǎn)次、分娩方式、體重指數(shù)、絕經(jīng)狀態(tài)、相關(guān)病史等可能影響SUI發(fā)生發(fā)展的重要混雜因素匹配的前提下,選取3例絕經(jīng)后SUI與3例絕經(jīng)后無(wú)SUI對(duì)照病例的尿道旁陰道前壁組織標(biāo)本。提取總RNA,并行定量、質(zhì)檢。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,然后進(jìn)行TaqMan(R) Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0表達(dá)譜芯片研

7、究。
　　 2.結(jié)合本課題組前期.Affymetrix GeneChip(R)Human Genome U133 Plus2.0基因芯片結(jié)果(一種全新的“基因芯片～microRNA芯片”相結(jié)合的方法)以及microRNA靶基因數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行交叉比對(duì)篩選,獲得調(diào)控的靶基因,用MAS4.0軟件對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行基因功能分類注釋(GO)和代謝通路分析(Pathway)。
　　 3.進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量至各組10例,采用實(shí)時(shí)熒光定量PC

8、R、免疫組化技術(shù)、WesternBlot技術(shù)檢測(cè)絕經(jīng)后SUI組和對(duì)照組差異microRNA、靶基因mRNA和蛋白水平的表達(dá),驗(yàn)證芯片的準(zhǔn)確性,以進(jìn)一步分析差異表達(dá)的microRNA及靶基因在SUI發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　 ●研究結(jié)果
　　 1.提取總RNA經(jīng)定量和電泳檢測(cè),質(zhì)量滿足芯片分析要求。芯片各項(xiàng)檢測(cè)參數(shù)均達(dá)到質(zhì)控要求,成功建立尿道旁陰道壁組織與microRNA表達(dá)譜芯片的研究模型。
　　 2.microR

9、NA表達(dá)譜芯片篩選出12個(gè)在SUI組和對(duì)照組間差異表達(dá)的microRNA,其中5個(gè)表達(dá)上調(diào),7個(gè)表達(dá)下調(diào)。
　　 3.通過(guò)結(jié)合本課題組前期基因芯片結(jié)果以及microRNA靶基因數(shù)據(jù)庫(kù),交叉比對(duì)、雙向預(yù)測(cè)篩選出4個(gè)靶基因GRB2、BICD2、STAT3、RAPTOR(其中GRB2、BICD2和STAT3表達(dá)上調(diào),RAPTOR表達(dá)下調(diào)),其功能基本與神經(jīng)變性相關(guān)。負(fù)向調(diào)控其功能的4個(gè)相對(duì)應(yīng)的差異microRNA分別為hsa—miR-

10、124,hsa—miR-330—3p,hsa-miR-93＃,hsa-let-7a(其中hsa—miR-124、hsa—mir-330—3p、hsa—miR-93＃表達(dá)下調(diào),hsa—let-7a表達(dá)上調(diào))。
　　 4.經(jīng)基因功能分類注釋(GO)和代謝通路分析(Pathway),這四個(gè)靶基因分別代表3個(gè)不同通路,GRB2為神經(jīng)變性相關(guān)基因；RAPTOR為signaling pathway通路的代表基因；BICD2、STAT3為物質(zhì)

11、代謝通路的功能基因,其蛋白功能也與神經(jīng)變性相關(guān),亦可歸類于神經(jīng)變性相關(guān)基因。
　　 5.進(jìn)一步驗(yàn)證表明microRNA、靶基因及蛋白水平的差異表達(dá)趨勢(shì)與芯片結(jié)果一致。
　　 ●結(jié)論
　　 1.microRNA表達(dá)譜芯片篩選出12個(gè)在SUI組和對(duì)照組間差異表達(dá)的microRNA,其中5個(gè)表達(dá)上調(diào),7個(gè)表達(dá)下調(diào)。
　　 2.基因表達(dá)譜芯片與microRNA表達(dá)譜芯片的結(jié)合可以大幅度縮小microRNA與靶基因