蕓薹生鏈格孢(Alternaria brassicicola)AbSte12基因的鑒定及功能研究.pdf

1、蕓薹生鏈格孢(Alternaria brassicicola)對環(huán)境與寄主有很強(qiáng)的適應(yīng)性，廣泛分布于自然界中，常引起十字花科蔬菜黑斑病，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。此外，蕓薹生鏈格孢也是世界上許多地區(qū)的氣源性致病源，已經(jīng)成為日益公認(rèn)的導(dǎo)致哮喘、致命性哮喘惡化的危險(xiǎn)因素。早期研究顯示，F(xiàn)US3/KSS1-MAPK信號途徑在蕓薹生鏈格孢致病過程中起到重要的調(diào)控作用，但對于其下游轉(zhuǎn)錄因子STE12的功能、作用機(jī)理及調(diào)控基因尚不清楚。
　　本研究

2、主要以蕓薹生鏈格孢菌（A.brassicicola）為對象，通過構(gòu)建 AbSte12基因缺失突變體(ΔAbSte12)、AbSte12基因互補(bǔ)體(C)，與野生菌(Wild-type,WT)對比研究，進(jìn)而深入了解轉(zhuǎn)錄因子STE12的生物學(xué)功能，分析其下游靶標(biāo)基因，探索其調(diào)控機(jī)制。主要結(jié)果如下：
　　1. AbSte12基因的生物信息學(xué)分析。
　　以釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) Ste12（ NP

3、_011952.1）和大麥網(wǎng)斑病菌（Pyrenophora teres f. teres）的一個(gè)同源基因（XP_003303640.1)為查詢，在已構(gòu)建的蕓薹生鏈格孢基因組數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行本地比對，找到A.brassicicola中Ste12的同源基因，命名為AbSte12。設(shè)計(jì)特異性引物從蕓薹生鏈格孢菌中成功擴(kuò)增AbSte12基因DNA及cDNA，該基因全長2364bp，含有3個(gè)內(nèi)含子，cDNA2091bp，編碼696個(gè)氨基酸。DNAMA

4、N分析顯示AbSte12與不同Ste12-like基因氨基酸序列具有很高的同源性。通過 SMART預(yù)測網(wǎng)站對 A.brassicicola Ste12氨基酸序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該基因與其他多數(shù) Ste12-like基因編碼的氨基酸序列N末端都具有典型的Ste-homolog結(jié)構(gòu)域，C末端包含兩個(gè)C2H2的鋅指結(jié)構(gòu)域，而后者在釀酒酵母中不存在。利用MEGA6.0分析不同Ste12-like基因系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，顯示A.brassicicola

5、AbSte12與灰葡萄孢（Botrytis cinerea）Ste12、菌核雪腐病菌（Sclerotinia borealis）Ste12親緣關(guān)系最近。
　　2.ΔAbSte12突變體的構(gòu)建。
　　構(gòu)建AbSte12打靶載體A+M+B，獲取 A.brassicicola原生質(zhì)體并通過PEG介導(dǎo)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，在含有潮霉素的培養(yǎng)基上篩選出轉(zhuǎn)化子，設(shè)計(jì)特異性引物通過普通 PCR驗(yàn)證篩選，得到ΔAbSte12突變體。此外，通過 Sout

6、hern雜交技術(shù)驗(yàn)證為潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因單拷貝插入ΔAbSte12突變體。
　　3. AbSte12基因的功能研究。
　　在菌落表型、分生孢子的形成、致病力以及菌絲穿透能力等方面對比分析ΔAbSte12突變體與野生菌的差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ΔAbSte12突變體在PDA培養(yǎng)基上生長速度減緩且不能產(chǎn)生成熟分生孢子。采用離體葉片接種法接種油菜葉片，ΔAbSte12突變體不能侵染葉片組織，致病力喪失。此外，利用覆有滅菌玻璃紙的PDA的培

7、養(yǎng)基培養(yǎng)ΔAbSte12突變體及野生菌，發(fā)現(xiàn)ΔAbSte12突變體不能穿透玻璃紙?jiān)俅紊L。構(gòu)建互補(bǔ)體后，其生物學(xué)性狀等均恢復(fù)到野生菌水平。由此可以推測，在蕓薹生鏈格孢菌中，AbSte12基因參與調(diào)控菌絲營養(yǎng)體生長、分生孢子的形成、穿透力以及致病性。
　　4. AbSte12基因下游部分調(diào)控基因的鑒定。
　　利用Real time PCR技術(shù)對ΔAbSte12突變體及野生菌cDNA進(jìn)行對比分析，結(jié)果初步證實(shí)轉(zhuǎn)錄因子AbSte1