極細(xì)鏈格孢菌HOG1、PBS2基因克隆及功能初步分析.pdf

1、鏈格孢菌既是一類重要植物病原真菌,又是具有應(yīng)用前景的生物資源.從分子水平研究該類菌的功能基因的調(diào)控機(jī)制,對(duì)進(jìn)一步開發(fā)利用該菌具有重要意義.HOG途徑參與誘導(dǎo)脅迫反應(yīng)基因的表達(dá)、細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)、信息素反應(yīng)途徑的阻遏及致病性等過(guò)程.Hoglp和Pbs2p蛋白激酶在細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)完整性、孢子分化、菌絲形成和浸入生長(zhǎng)以及高滲透壓甘油形成過(guò)程中起到重要作用.本研究通過(guò)運(yùn)用基于λ噬菌體特異位點(diǎn)重組反應(yīng)Gateway 系統(tǒng)構(gòu)建極細(xì)鏈格孢菌(Alternar

2、ia tenuissima)cDNA表達(dá)文庫(kù).通過(guò)遺傳手段，篩選獲得了極細(xì)鏈格孢菌(Atenuissima)AtHOG1及AtPBS2基因,并研究了AtHOG1及AtPBS2基因的功能，建立了以抗性基因作為選擇標(biāo)記的技術(shù)體系。利用DNA同源重組技術(shù),成功構(gòu)建了用于敲除極細(xì)鏈格孢菌(A.tenuissima)AtHOG1及AtPBS2基因的質(zhì)粒,為進(jìn)一步研究AtHDG1及AtPBS2基因的功能奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。 1.鏈格孢屬(Al

3、ternaria Nees)真菌是一類龐大的,難以進(jìn)行形態(tài)鑒定的常見真菌.為了進(jìn)一步確定本試驗(yàn)所用菌種的分類地位,本文成功克隆了rDNA基因.通過(guò)序列比對(duì),構(gòu)建了7個(gè)相似菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹,發(fā)現(xiàn)該菌株與極細(xì)鏈格孢菌(A. tenuissima)相應(yīng)的rDNA高度同源,因此將鏈格孢菌JH505菌株定名為極細(xì)鏈格孢菌(A. tenuissima). 2.構(gòu)建了含有attL1及attL2重組位點(diǎn)的重組表達(dá)質(zhì)粒(pRS-DEST42),使

4、用Gateway LR重組技術(shù)與入門文庫(kù)發(fā)生特異重組交換而構(gòu)建表達(dá)文庫(kù).經(jīng)檢測(cè),表達(dá)文庫(kù)的平均滴度為2.44x10<'6>(cfu/ml),文庫(kù)總?cè)萘繛?.44x10<'7>.陽(yáng)性克性率為100﹪,平均插入片段大約為1381 bp左右.通過(guò)對(duì)陽(yáng)性克隆測(cè)序結(jié)果的分析,cDNA序列完整. 3.從7.62×10<'5>個(gè)極細(xì)鏈格孢菌(A.tenuissima)cDNA表達(dá)文庫(kù)酵母轉(zhuǎn)化子中篩選獲得了12個(gè)能使酵母hogl基因缺失突變株在

5、YEPD+1MNaCl中生長(zhǎng)且含有極細(xì)鏈格孢菌(A.tenuissima)cDNA表達(dá)文庫(kù)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子.這些基因編碼的蛋白質(zhì)序列均與酵母HOG1(ScHOG1)基因編碼的355個(gè)氨基酸同源,命名為AtHOG1,其編碼的蛋白質(zhì)命名為AtHoglp,該基因編碼的蛋白與稻瘟菌MG01822.4蛋白、黑粉菌UM02357.1蛋白、禾谷鐮刀菌FG09612.1蛋白及釀酒酵母ScHoglp蛋白的相似性分別為96﹪、92﹪、90﹪和88﹪.序列比對(duì)結(jié)

6、果顯示,酵母ScHoglp蛋白的催化結(jié)構(gòu)域與其同源蛋白具高度保守,而且三個(gè)催化位點(diǎn)及賴氨酸殘基均位于ATP結(jié)合域內(nèi),說(shuō)明Hoglp蛋白在絲狀真菌中是高度保守的. 4.從1.56×10<'5>個(gè)轉(zhuǎn)化子中最終分離而獲得了1個(gè)能使酵母pbs2缺失突變株在高鹽環(huán)境下生長(zhǎng)的表達(dá)文庫(kù)質(zhì)粒.該基因全長(zhǎng)2,492 bp,編碼683個(gè)氨基酸.與酵母ScPbs2p蛋白具有42.6﹪的同源性,命名為AtPBS2,其編碼的氨基酸為AtPbs2p.AtP

7、bs2p與煙曲霉XP_752961、稻瘟菌XP 366048及禾谷鐮刀菌XP_388867同源序列分別具有55.3﹪、50.2﹪和48.6﹪的相似性.ScPbs2p的催化結(jié)構(gòu)域在絲狀真菌也是高度保守的. 5.通過(guò)對(duì)極細(xì)鏈格孢菌(A.tenuissima)cDNA表達(dá)文庫(kù)的篩選,獲得能使釀酒酵母HOG1及PBS2基因缺失突變株具有對(duì)抗鹽脅迫反應(yīng)的質(zhì)粒,通過(guò)對(duì)AtHOG1及AtPBS2基因在酵母突變菌株中的再次功能驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)AtHO

8、G1及AtPBS2基因分別發(fā)揮了HOG通路途徑的HOG1及PBS2基因的功能,即在鹽脅迫條件下體現(xiàn)出與ScHoglp及ScPbs2p蛋白相同的功能,使酵母缺失突變株在高鹽環(huán)境中生長(zhǎng). 6.基于極細(xì)鏈格孢菌(A.tenuissima)在含有G418(100 μg/m1)和潮霉素(Hygromycin B)(100μg/ml)的PDA培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)的藥物敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果,建立了用G418抗性基因及潮霉素(Hygromycin B)抗

9、性基因作為選擇標(biāo)記的技術(shù)體系,從而為研究極細(xì)鏈格孢菌(A.tenuissima)功能基因的敲除、缺失突變株鑒定提供了可靠的篩選標(biāo)記,并為后續(xù)研究打下必要的基礎(chǔ). 7.利用同源重組技術(shù),分別選擇以AtHOG1及AtPBS2基因上下游同源序列約500 bp作為同源臂,上游同源序列3'端連接G418抗性基因,以保證缺失突變株的檢測(cè)及鑒定.成功構(gòu)建了用于敲除極細(xì)鏈格孢菌(A tenuissima)AtHOG1及AtPBS2基因的質(zhì)粒,為