復(fù)肝靈抗鴨體內(nèi)乙型肝炎病毒的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、乙型病毒型肝炎是世界性的常見(jiàn)傳染病，也是嚴(yán)重威脅我國(guó)人民健康的重大疾病[1]，據(jù)有關(guān)資料顯示，全世界約有3億乙型肝炎病毒感染者，僅中國(guó)就近1億人，且每年新增3000萬(wàn)乙肝患者，而這一數(shù)字目前正呈上升趨勢(shì)。目前尚缺乏理想的治療藥物，尤其是確實(shí)有效的抗乙肝病毒藥物。“復(fù)肝靈”是山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院研制的具有良好抗肝炎病毒作用的中藥顆粒劑，其處方組成：草木樨、茵陳、金錢(qián)草、黃芩、梔子等。以特定的工藝制為細(xì)顆粒，裝袋。功效：清熱解毒、疏肝利膽。為驗(yàn)證

2、其體內(nèi)抗乙肝病毒作用，本實(shí)驗(yàn)采用鴨乙型肝炎病毒感染雛鴨口服復(fù)肝靈進(jìn)行實(shí)驗(yàn)治療，觀察其對(duì)鴨血清鴨乙型肝炎病毒DNA水平的影響，并與拉米夫定進(jìn)行比較。 目的： 為復(fù)肝靈臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為從該中藥中分離尋找有效成分，研制新型抗乙型肝炎病毒藥物和保護(hù)肝細(xì)胞藥物奠定理論學(xué)基礎(chǔ)。 材料和方法： 1.1藥物：復(fù)肝靈：由山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供。該藥為棕色顆粒劑，用生理鹽水配制。拉米夫定為葛蘭素威康制藥公司產(chǎn)品，用生理

3、鹽水配制。 1.2病毒：采用健康成年的上海麻鴨產(chǎn)的蛋孵化的1日齡雛鴨，取接種后DHBV-DNA陽(yáng)性血清0.2ml，-70℃保存。 1.3動(dòng)物：1日齡北京鴨，購(gòu)自北京前進(jìn)種鴨場(chǎng)動(dòng)物飼養(yǎng)場(chǎng)。 1.4試劑：α-32p-dCTP購(gòu)自北京福瑞生物技術(shù)工程公司。缺口翻譯藥盒購(gòu)自普洛麥格公司（PromegaCo，）；SephadexG-50，F(xiàn)icollPVP購(gòu)自瑞典Pharmacia公司；SDS西德Merck公司產(chǎn)品；魚(yú)精D

4、NA、牛血清白蛋白為中國(guó)科學(xué)院生物物理所產(chǎn)品；硝酸纖維素膜0.45umAmersham公司產(chǎn)品。 1.5實(shí)驗(yàn)方法與分組： 1.5.1.鴨乙型肝炎病毒模型的建立：1日齡北京鴨89只，經(jīng)腿脛靜脈注射雛鴨DHBV-DNA陽(yáng)性血清，每只0.2ml，在感染后7天取血，分離血清，-70℃保存待檢。 1.5.2實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)分三批同時(shí)進(jìn)行：第一批實(shí)驗(yàn)：DHBV感染7天后30只1日齡北京鴨隨機(jī)分為復(fù)肝靈組（18只）、病毒對(duì)照組（6

5、只）和拉米夫定組（6只）。復(fù)肝靈組又分為0.5g，1.0g，2.0g/kg3個(gè)劑量組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每組6只，口服藥物，1天2次，給藥10天；病毒對(duì)照組（DHBV）以生理鹽水代替藥物；拉米夫定組給予口服拉米夫定，50mg/kg，1天2次，用藥10天。在感染后第7天即用藥前（T0），用藥第5天（T5），用藥第10天（T10）和停藥后第3天（P3），自鴨腿脛靜脈取血，分離血清，-70℃保存待檢。第二批實(shí)驗(yàn)：DHBV感染7天后29只1日齡北京鴨隨機(jī)

6、分為復(fù)肝靈組（18只）、病毒對(duì)照組（5只）和拉米夫定組（6只），實(shí)驗(yàn)方法同第一批實(shí)驗(yàn)。第三批重復(fù)實(shí)驗(yàn)：分組及實(shí)驗(yàn)方法同第一批實(shí)驗(yàn)。 1.6鴨血中DHBV檢測(cè)方法：取上述待檢鴨血清，每批同時(shí)點(diǎn)膜，測(cè)定鴨血清中DHBV-DNA水平。按缺口翻譯試劑盒說(shuō)明書(shū)方法，用32P標(biāo)記DHBV-DNA探針，并作鴨血清斑點(diǎn)雜交，放射自顯影膜片斑點(diǎn)，在酶標(biāo)檢測(cè)儀測(cè)定光密度OD值（濾光片為490nm），計(jì)算血清DHBV-DNA密度，以雜交斑點(diǎn)OD值作為

7、標(biāo)本DHBV-DNA水平值。 1.7觀察指標(biāo)： 1.7.1計(jì)算每組鴨不同時(shí)間血清DNA-OD值的平均值（X±S），并將每組鴨用藥后不同時(shí)間（T5、T10）和停藥后第3天（P3）血清DHBV-DNA水平與同組給藥前（T0）0D值比較，采用t檢驗(yàn)，計(jì)算t1、P1值，分析差異的顯著性，判斷藥物對(duì)病毒感染的抑制效果（見(jiàn)表1）。 1.7.2計(jì)算每組鴨用藥后不同時(shí)間（T5、T10）和停藥第3天（P3）血清DHBV-DNA的抑

8、制率（％）。計(jì)算公式為：DNA抑制％=給藥前（T0）OD值-給藥后（T5，T10，P3）0D值/給藥前（T0）0D值×100％將復(fù)肝靈組不同時(shí)間鴨血清DHBV-DNA抑制率分別與對(duì)照組和拉米夫定組各相應(yīng)時(shí)間DHBV-DNA抑制率進(jìn)行比較，采用t檢驗(yàn)，計(jì)算t2，P2值，分析差異的顯著性。 結(jié)果： 2.1各組鴨血清DHBV-DNAOD值在用藥前后的變化 2.1.1復(fù)肝靈組：三批實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：復(fù)肝靈2.0g/kg組，給

9、藥后第5天，第10天鴨血清DHBV-DNA顯著下降（P<0.01），停藥后3天鴨血清DHBV-DNA下降明顯（P<0.05），鴨血清DHBV-DNA水平抑制率則有顯著升高；1.0g/kg組，給藥后第10天和停藥后3天鴨血清DHBV-DNA明顯下降，鴨血清DHBV-DNA水平抑制率則有顯著升高，與對(duì)照組差異顯著（P<0.01），與拉米夫定組則無(wú)明顯區(qū)別；0.5g/kg組則無(wú)明顯變化。結(jié)論：大劑量組、中等劑量的復(fù)肝靈組在鴨體內(nèi)有抗鴨乙型肝炎

10、病毒作用。 2.1.2拉米夫定對(duì)照組：鴨用藥后第5天，10天（T5、T10）鴨血清DHBV-DNAOD值較用藥前（T0）明顯降低（P<0.01），但停藥后第3天（P3）出現(xiàn)反彈（P>0.05）。 2.2鴨乙型肝炎病毒感染鴨體內(nèi)各組鴨血清DHBV-DNA抑制率的比較與病毒對(duì)照組比較，鴨血清DHBV-DNA抑制率在復(fù)肝靈2.0g/kg組在用藥后不同時(shí)間（T5、T10）有顯著升高（P<0.01）；1.0g/kg組在用藥后第5天