三氧化二砷抗鴨乙型肝炎病毒的體內(nèi)實(shí)驗(yàn).pdf

1、目的：創(chuàng)建鴨乙型肝炎病毒(DHBV)~ccDNATaqMan熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(FQ-PCR)檢測(cè)方法，建立福州麻鴨后天感染乙型肝炎動(dòng)物模型，觀察三氧化二砷(As203)在體內(nèi)對(duì)DHBVDNA和DHBVcccDNA的抑制作用，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。 方法：用PUCm—T載體和DHBVcccDNAPCR純化產(chǎn)物連接，轉(zhuǎn)染TOPl0菌，篩選陽(yáng)性菌落，提取質(zhì)粒，制作標(biāo)準(zhǔn)品；在DHBV基因組負(fù)鏈缺口兩側(cè)設(shè)計(jì)一對(duì)引物，并在引物間設(shè)

2、計(jì)和熒光標(biāo)記一段TaqMan探針，嚴(yán)格優(yōu)化反應(yīng)物的組成和擴(kuò)增條件，建立TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)方法。篩選1日齡DHBVDNA(．)雛鴨，經(jīng)靜脈途徑接種DHBVDNA強(qiáng)陽(yáng)性血清，建立福州麻鴨后天感染乙型肝炎動(dòng)物模型：隨機(jī)分組，實(shí)驗(yàn)組、拉米夫定對(duì)照組和空白對(duì)照組分別用As2O3、拉米夫定和0．9％氯化鈉溶液處理4w，停藥后觀察1w。用TaqMan熒光定量PCR法檢測(cè)治療前后血清中DHBVDNA和用藥后肝組織內(nèi)DHBVDNA和DHBVc

3、∞D(zhuǎn)NA含量，并檢測(cè)血清ALT、AST水平及肝組織HE染色病理。 結(jié)果：建立的DHBVcccDNATaqMan熒光定量PCR法靈敏度為l03copies／ml；在105一l09copies／ml之間，含量與Ct值具有很好的線性，Ct=一2．8361ln(x)+41．45，r：一0．9985；批內(nèi)誤差為O．2％～3．14％，批間誤差為2．22％～4．43％。動(dòng)物模型用藥4w后，As2O3治療組的病毒抑制率顯著高于空白對(duì)照組(分別是

4、9．19％和．5．12％，P<0．05)，抗病毒效果與用藥劑量和用藥時(shí)間相關(guān)。停藥1w后，As2O3治療組血清DHBVDNA含量無(wú)反跳現(xiàn)象，肝組織DHBVDNA含量顯著低于空白對(duì)照組，肝組織內(nèi)DHBVcccDNA含量跟空白對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異。治療4w和停藥1w后血清ALT、AST及肝臟病理檢查結(jié)果，As203治療組與空白對(duì)照組無(wú)顯著性差異。 結(jié)論：TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)方法是一種靈敏度高、特異性強(qiáng)的DNA定量檢測(cè)技術(shù)