抗乙型肝炎病毒藥物篩選評(píng)價(jià)體系的建立及肝康栓抗乙型肝炎病毒的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　 建立一套檢測(cè)乙型肝炎病毒基因的Taqman探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)、分別利用HepG2.2.15細(xì)胞模型和鴨乙型肝炎模型于體外、體內(nèi)研究乙型肝炎病毒，從而建立并完善抗乙型肝炎病毒藥物篩選、評(píng)價(jià)體系。并利用該體系評(píng)價(jià)肝康栓體內(nèi)、外抗乙型肝炎病毒的作用。
　　 方法:
　　 1.根據(jù)病毒基因組和核苷酸序列特點(diǎn)，分別設(shè)計(jì)3對(duì)特異性引物及Taqman探針。利用這3對(duì)引物分別擴(kuò)增HBV DNA、DHBV D

2、NA及DHBV cccDNA目的基因片段。PCR產(chǎn)物純化、回收后，克隆入pUCm-T載體，轉(zhuǎn)化DH5a菌株，篩選陽(yáng)性菌落，提取重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)PCR及測(cè)序鑒定后，用于制備實(shí)時(shí)熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)品和繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)體系和循環(huán)參數(shù)，建立乙型肝炎病毒基因Taqman探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)。并進(jìn)一步評(píng)價(jià)該系統(tǒng)的靈敏度、特異度及可重復(fù)性。
　　 2.體外培養(yǎng)HepG2.2.15細(xì)胞，觀察該細(xì)胞培養(yǎng)1、2、4、6、8

3、、10、12、14天時(shí)的生長(zhǎng)情況和HBsAg、HBeAg的分泌情況。用MTT法檢測(cè)肝康栓和拉米夫定對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用，計(jì)算肝康栓和拉米夫定的半數(shù)中毒濃度。并分別用ELISA法或PCR法檢測(cè)肝康栓（12mg/ml、10mg/ml、6mg/ml和5mg/ml的終濃度）與拉米夫定（0.2mg/ml、1mg/ml、5mg/ml和25mg/ml的終濃度）作用4、7、10天時(shí)，HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HBsAg、H

4、BeAg、HBV DNA的抑制作用。計(jì)算培養(yǎng)第10天時(shí)肝康栓和拉米夫定抑制HepG2.2.15細(xì)胞上清液中HBsAg、HBeAg分泌及HBV DNA復(fù)制的半數(shù)有效濃度。最后評(píng)價(jià)肝康栓的選擇指數(shù)。
　　 3.分別提取244份武漢地區(qū)成年櫻桃谷鴨血清中的DHBV DNA，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增和瓊脂糖凝膠電泳。估計(jì)武漢地區(qū)成年櫻桃谷鴨DHBV攜帶率。取1日齡櫻桃谷雛鴨96只，利用PCR法篩選先天DHBV DNA（－）雛鴨用于制備動(dòng)物模型，

5、并估計(jì)櫻桃谷雛鴨DHBV自然感染率。通過(guò)脛靜脈注射DHBV DNA強(qiáng)陽(yáng)性血清（0.2ml/只），利用先天DHBV DNA（－）雛鴨制備后天感染鴨乙型肝炎病毒動(dòng)物模型，并計(jì)算DHBV造模感染率。
　　 4.采用正常櫻桃谷雛鴨研究肝康栓短期毒性反應(yīng)。將后天感染鴨乙型肝炎病毒動(dòng)物模型雛鴨隨機(jī)分為：模型對(duì)照組，ACV對(duì)照組，大、中、小劑量肝康栓治療組，每組12只；再取12只2周齡的正常雛鴨作為正常對(duì)照組。分別于第一次給藥前（T0）、給藥

6、14d（T14）、給藥28d（T28）和停藥7d（P7）時(shí)，脛靜脈取血（0.5ml/只），分離血清，檢測(cè)肝康栓對(duì)雛鴨血清中DHBV DNA的抑制情況和血清ALT、AST的影響。并于停藥7d時(shí)將各組鴨處死，統(tǒng)一取肝右葉2塊組織，分別用于檢測(cè)肝臟DHBV DNA、DHBV cccDNA和組織病理學(xué)。
　　 結(jié)果:
　　 1.本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了pUCm-HBV DNA、pUCm-DHBV DNA和pUCm-DHBV cccDN

7、A三種質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。在（1×102～1×109）copies/ml濃度范圍內(nèi)，三種標(biāo)準(zhǔn)品的含量與Ct值的相關(guān)系數(shù)r分別為-1.00、－0.999和－0.997。（5×103～5×108）copies/ml 6個(gè)濃度的三種質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，在同一實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上重復(fù)進(jìn)行4次擴(kuò)增，Ct值的變異系數(shù)均小于5%。利用本實(shí)驗(yàn)所建立的Taqman探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)檢測(cè)HBV DNA、DHBV DNA和DHBV cccDNA的靈敏度分別為：5×

8、101copies/ml、5×101copies/ml和1×102copies/ml；并且HBV DNA陽(yáng)性上清液、DHBV DNA陽(yáng)性鴨血清和DHBV cccDNA陽(yáng)性鴨肝組織用本法檢測(cè)均出現(xiàn)陽(yáng)性擴(kuò)增，而空白的培養(yǎng)基、正常鴨血清及正常鴨肝組織均未出現(xiàn)陽(yáng)性擴(kuò)增。
　　 2.①HepG2.2.15細(xì)胞按1×106/L濃度接種、培養(yǎng)后，第8～12天細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)最佳；并且用ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)1天后，檢測(cè)細(xì)胞上清液中的H

9、BsAg和HBeAg均為陽(yáng)性，其后培養(yǎng)上清液中HBsAg及HBeAg的分泌量隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)而逐漸增加，在培養(yǎng)第10天達(dá)到高峰。培養(yǎng)第1-6天時(shí)HBsAg分泌增長(zhǎng)速度較HBeAg快；但是整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中，HBeAg分泌量均高于同時(shí)期HBsAg的分泌量。
　　 ②肝康栓在（7.5～60）mg/ml濃度范圍內(nèi)，對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞增殖的抑制作用隨肝康栓的濃度增加而增強(qiáng)，當(dāng)肝康栓濃度小于15mg/ml時(shí)，對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率<20

10、%。
　　 ③12mg/ml的肝康栓作用10天后，HBsAg、HBeAg的抑制率達(dá)最大，分別為68.2%和62.7%。呈明顯的時(shí)間和劑量依賴性；而3TC在25mg/ml濃度下作用7天，HBsAg、HBeAg的抑制率最大，分別為50.1%和47.3%。且3TC培養(yǎng)10天時(shí)，HBsAg、HBeAg的抑制率均較培養(yǎng)7天時(shí)減弱。無(wú)明顯的時(shí)間依賴性。
　　 ④肝康栓在12mg/ml濃度、作用10天時(shí)，對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞上清

11、中HBV DNA的抑制率較強(qiáng)，為78.8%；而3TC在25mg/ml濃度、作用10天時(shí)，對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞上清中HBV DNA的抑制率最強(qiáng)，為97.9%。
　　 ⑤肝康栓和3TC抑制HBV DNA的選擇指數(shù)分別為6.14和31450.5。
　　 3.在244份武漢地區(qū)采集的成年櫻桃谷鴨血清標(biāo)本中，52份為DHBV DNA陽(yáng)性血清，估計(jì)武漢地區(qū)成年櫻桃谷鴨DHBV攜帶率為：[16.64%～26.87%]（95%置

12、信區(qū)間）。而96只1日齡櫻桃谷雛鴨中，在接種前檢測(cè)DHBV DNA，只有11只為DHBV DNA陽(yáng)性，估計(jì)櫻桃谷雛鴨DHBV自然感染率為[6.52%～19.36%]（95%置信區(qū)間）。隨機(jī)選取1日齡DHBV DNA(－)的櫻桃谷雛鴨80只，接種DHBV DNA強(qiáng)陽(yáng)性血清1周后，69只為DHBV DNA陽(yáng)性，8只為陰性，3只死亡，DHBV造模感染率為86.25%。
　　 4.①肝康栓大、中、小劑量組雛鴨給藥前、給藥7天、給藥14

13、天、給藥28天時(shí)，與對(duì)照組雛鴨相比，在羽毛色澤，步態(tài)，進(jìn)食狀況，精神狀態(tài)，對(duì)刺激的反應(yīng)等方面也均無(wú)明顯差異；各組雛鴨在試驗(yàn)各階段，體重及體重增重值均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p>0.05）。
　　 ②肝康栓大劑量組雛鴨血清DHBV DNA始終低于同期其他組，且在停藥7天時(shí)下降至最低（p<0.01）；肝康栓大、中劑量組在停藥7天后DHBV DBA均未出現(xiàn)反彈，而肝康栓小劑量組及ACV對(duì)照組均有不同程度的反彈。
　　 ③停藥7天時(shí)，肝康

14、栓大劑量組雛鴨肝組織DHBV DNA和DHBV cccDNA均受明顯抑制，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。
　　 ④與同期模型組比較，肝康栓中、大劑量組雛鴨在治療28天和停藥7天時(shí)血清ALT明顯降低，有顯著差異（p<0.01）。肝康栓大劑量組雛鴨在治療14天時(shí)血清AST也明顯降低，有顯著差異（p<0.05）；與同期ACV對(duì)照組比較，肝康栓大劑量組在給藥28天時(shí)，血清ALT明顯降低，有顯著差異（p<0.05）。停藥7天時(shí)，肝康栓

15、中、大劑量組ALT也明顯降低，有顯著差異（p<0.05）。而ACV對(duì)照組在治療過(guò)程中ALT、AST均未見(jiàn)顯著下降。
　　 ⑤肝組織病理檢查結(jié)果顯示：肝康栓小、中、大劑量組與模型組相比，匯管區(qū)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和肝細(xì)胞點(diǎn)、灶狀壞死均有不同程度的改善。其中肝康栓大、中劑量組改善較為明顯。
　　 結(jié)論:
　　 1.本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了一套檢測(cè)乙型肝炎病毒基因的Taqman探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)，并且通過(guò)方法學(xué)評(píng)價(jià)該系統(tǒng)具有

16、很好的靈敏度、特異度和可重復(fù)性?；窘⒘艘惶纵^完善的抗乙型肝炎病毒藥物篩選、評(píng)價(jià)體系。
　　 2.培養(yǎng)第8～12天的HepG2.2.15細(xì)胞處于生長(zhǎng)高峰期，在此期進(jìn)行藥物實(shí)驗(yàn)較適宜。肝康栓體外實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞毒性較小，并且對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HBsAg、HBeAg及HBV DNA有一定的抑制作用。
　　 3.武漢地區(qū)成年櫻桃谷鴨的DHBV攜帶率不高，其雛鴨DHBV自然感染率較低，適用于制備感染DHBV的

17、鴨乙型肝炎動(dòng)物模型。并且在本研究中成功制備了后天感染DHBV的櫻桃谷雛鴨模型。
　　 4.肝康栓對(duì)雛鴨無(wú)明顯短期毒性作用，初步提示肝康栓作為治療慢性乙型肝炎的藥物是安全的。肝康栓能抑制模型雛鴨血清中的DHBV DNA，且存在一定的劑量和時(shí)間依賴性。肝康栓能有效抑制模型雛鴨肝組織中的DHBV DNA和DHBV cccDNA。肝康栓還能改善雛鴨的血清生化學(xué)和肝組織病理學(xué)。我們認(rèn)為這些作用除了與肝康栓能有效抑制DHBV DNA的復(fù)制