人蛔蟲提取物抗腫瘤作用及其機制的實驗研究.pdf

1、目的： 通過體內(nèi)外試驗，探討人蛔蟲提取物（body extract of Ascaris lumbricoides，BEAL）對小鼠LLC細胞株的細胞毒作用，建立小鼠LLC荷瘤模型，探討人蛔蟲提取物對腫瘤的作用及其免疫學(xué)機制。 方法： 1.人蛔蟲提取物的制備：對蛔蟲感染者一次口服雙羥萘酸噻嘧啶（30mg/Kg體重），服藥后從糞便中收集蛔蟲成蟲。取完整的蛔蟲洗凈后用含100U/ml青霉素、鏈霉素的無菌生理鹽水浸泡1

2、5分鐘，濾紙吸干，在超凈臺內(nèi)解剖蛔蟲，取出內(nèi)臟丟棄，收集蟲體，用勻漿器攪碎后，在10，000×g離心30分鐘，取上清，經(jīng)0.45μm醋酸纖維膜過濾除菌，用核酸蛋白分析儀測蛋白含量為3200μg/ml，置-30℃儲藏備用。 2.腫瘤細胞的篩選：小鼠Lewis肺癌細胞株（LLC）、小鼠肝癌細胞株（Hepa1-6）和小鼠淋巴瘤細胞株（EL4）均購自中國科學(xué)院上海細胞研究所細胞庫。用四氮唑鹽酶還原法（microculture tetra

3、zolium test，MTT）檢測人蛔蟲提取物對三種腫瘤細胞的細胞毒作用，以篩選出最敏感細胞株和最佳作用濃度。 3.繪制LLC細胞生長曲線：取對數(shù)生長期的LLC細胞常規(guī)消化，用RPMI-1640+10％FCS培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度為1×105/ml，將細胞分別接種于24孔培養(yǎng)板中，1ml/孔，置37℃、5％CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天取三孔細胞進行消化后計數(shù)，取平均值，連續(xù)觀察7d。其余細胞隔2d換液，根據(jù)所得數(shù)據(jù)繪制細胞生長曲

4、線。 4.LLC細胞毒性實驗：取對數(shù)生長期的LLC細胞消化后，用RPMI1640+10％FCS的培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度為1×105/ml，加入96孔板，100μl/孔，置37℃、5％CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，棄去孔內(nèi)液體，加入不同濃度的BEAL（起始濃度為3200μg/ml的BEAL倍比稀釋至12.5μg/ml），每個濃度3個復(fù)孔，置37℃、5％CO2的細胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24h、48h、72h。棄去孔內(nèi)液體，加入MTT，置3

5、7℃、5％CO2的細胞培養(yǎng)箱中。4h后取出，加入二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），置酶標(biāo)儀檢測OD492，取細胞存活率≥50％的BEAL濃度為誘導(dǎo)實驗的起始濃度。 5.荷瘤小鼠模型的建立：將LLC細胞株擴增后對小鼠進行腫瘤造模：以細胞密度為1×107/ml，0.1ml/只，接種于小鼠右前肢腋下皮下。 6.實驗分組：A組-人蛔蟲提取物事先干預(yù)組（BEAL+LLC）：腹腔注射濃度為100μg/ml

6、的BEAL，0.1ml/只，隔天一次，10d后腫瘤造模；B組-生理鹽水事先干預(yù)組（NS+LLC）：腹腔注射生理鹽水，0.1ml/只，隔天一次，10d后腫瘤造模；C組-腫瘤造模后提取物干預(yù)組（LLC+ BEAL）：以細胞密度為1×107/ml的LLC細胞懸液，0.1ml/只，接種于小鼠右前肢腋下皮下，2d后用BEAL干預(yù)，隔天一次；D組-腫瘤造模后生理鹽水干預(yù)組（LLC+NS）：以細胞密度為1×107/ml的LLC細胞懸液，0.1ml/只

7、，接種于小鼠右前肢腋下皮下，2d后用生理鹽水干預(yù)，隔天一次；E組-陰性對照組，正常飼養(yǎng)，不加任何處理。10d后處理各組小鼠進行實驗。 7.巨噬細胞的分離和培養(yǎng)：常規(guī)無菌狀態(tài)（詳細見下文）制備小鼠巨噬細胞，加入含有100U/ml青霉素、鏈霉素、10％FCS的RPMI1640培養(yǎng)液，調(diào)整細胞密度為1×106/ml，收集于24孔培養(yǎng)板中，置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 8.脾淋巴細胞的分離和培養(yǎng)：常規(guī)無菌狀態(tài)制備小鼠脾細胞

8、，加入含有100U/ml青霉素、鏈霉素、10％FCS的RPMI1640培養(yǎng)液，調(diào)整細胞密度為1×106/ml，收集于6孔培養(yǎng)板中，置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 9.細胞因子的表達：巨噬細胞和脾淋巴細胞培養(yǎng)72h后收集上清，用ELISA法檢測各實驗組培養(yǎng)上清中TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10的表達。 10.LLC細胞有絲分裂指數(shù)：普通光學(xué)顯微鏡下觀察有絲分裂相細胞，取細胞數(shù)多、中、少3個區(qū)域各一區(qū)，共計數(shù)

9、1000個細胞，計算出細胞有絲分裂指數(shù)（mitotic index；MI）。 11.胸腺和脾臟指數(shù)：人蛔蟲提取物干預(yù)荷瘤小鼠，10d后取出小鼠胸腺、脾臟稱重（mg），分別除以小鼠體重（g），得到胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。 12.統(tǒng)計學(xué)分析：用SPSS13.0處理各組實驗數(shù)據(jù)，對上述實驗結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析。實驗結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準差（x±S）表示。細胞毒實驗數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為細胞殺傷率后采用方差分析（F檢驗），HE染色計算細胞分裂指數(shù)所得數(shù)

10、據(jù)做平方根反正弦轉(zhuǎn)換，然后進行方差分析。ELISA數(shù)據(jù)直接進行方差分析，樣本均數(shù)的兩兩比較用q檢驗。P<0.05表示有顯著性差異，P>0.05表示無顯著性差異。 結(jié)果： 1.腫瘤細胞的篩選：MTT實驗結(jié)果顯示，BEAL對LLC、Hepa1-6和EL4三種腫瘤細胞均有細胞毒作用，但以LLC細胞最為敏感，根據(jù)實驗結(jié)果選取LLC為本實驗的靶細胞株。 2.細胞生長曲線：LLC細胞從第3d開始進入對數(shù)生長期，在第4d生長最

11、為旺盛，之后增殖減慢逐漸進入平臺期。 3.LLC細胞毒性實驗：當(dāng)BEAL濃度為200μg/ml時細胞存活率為51％，因此取200μg/ml為誘導(dǎo)LLC細胞的濃度上限。 4.LLC細胞有絲分裂指數(shù)：顯微鏡下觀察，各實驗組LLC細胞分裂指數(shù)均低于陰性對照組。在同一時間段內(nèi)，細胞分裂指數(shù)隨BEAL的濃度增加而降低，25μg/ml組的細胞分裂指數(shù)最高，800μg/ml濃度組的分裂指數(shù)最低，在同一濃度內(nèi)，細胞分裂指數(shù)隨時間延長而降

12、低。 5.BEAL對荷瘤小鼠腫瘤生長的影響：所有分組中小鼠荷瘤后BEAL干預(yù)的C組抑瘤率最強，為33.33％，腫瘤明顯小于同時干預(yù)的D組（P<0.05）；BEAL提前干預(yù)的A組腫瘤明顯大于B組，但A組與B組比較無明顯抑瘤作用；小鼠瘤重的兩兩比較顯示，A組與B、C、D組比較均有顯著性差異，C組與D組比較也有顯著性差異，其余組間兩兩比較無顯著性差異。 6.胸腺和脾臟指數(shù)：（1）胸腺指數(shù)：A組和B組均高于陰性對照的E組，其中B

13、組與E組比較有顯著性差異，A組低于B組，且有顯著性差異；C組和D組均低于陰性對照的E組，但無顯著性差異，C組高于D組，無顯著性差異。（2）脾臟指數(shù)：A組和B組均高于陰性對照的E組，A組與E組比較有顯著性差異，A組高于B組且有顯著性差異；C組與D組均高于E組，C組與E組比較有顯著性差異，C組高于D組但無顯著性差異。 7.DNA瓊脂糖凝膠電泳：經(jīng)BEAL誘導(dǎo)后的LLC細胞，其DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)具有凋亡特征的“梯狀”條帶，而對

14、照組未見此現(xiàn)象。 8.ELISA檢測：（1）腹膜巨噬細胞培養(yǎng)上清中A、B、C、D組的TNF-α含量均低于E組，但無顯著性差異；A、B、C、D組的IFN-γ含量均低于E組；A組的IL-4含量高于E組，但無顯著性差異，B、C、D組的IL-4含量均低于E組，且有顯著性差異。A、B、C、D組的IL-10含量均低于E組。（2）脾淋巴細胞培養(yǎng)上清中，A、B、C、D組的TNF-α含量均低于E組；A組的IFN-γ含量明顯高于E組，有顯著性差異，

15、其它各實驗組與E組比較均無顯著性差異；A、B、C、D組的IL-4含量均低于E組，與E組比較有顯著性差異；A組的IL-10含量明顯高于E組，有顯著性差異。 結(jié)論： 1.BEAL能夠?qū)w外培養(yǎng)的LLC產(chǎn)生細胞毒作用，并能夠誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡。BEAL對細胞的抑制率在一定范圍內(nèi)呈濃度和作用時間依賴性，在同一時間段內(nèi)當(dāng)BEAL濃度增加時，抑制率升高；在同一濃度下隨BEAL作用時間的延長，抑制率也增加。 2.BEAL可降低LL