人蛔蟲提取物抗腫瘤作用及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 通過(guò)體內(nèi)外試驗(yàn)，探討人蛔蟲提取物（body extract of Ascaris lumbricoides，BEAL）對(duì)小鼠LLC細(xì)胞株的細(xì)胞毒作用，建立小鼠LLC荷瘤模型，探討人蛔蟲提取物對(duì)腫瘤的作用及其免疫學(xué)機(jī)制。 方法： 1.人蛔蟲提取物的制備：對(duì)蛔蟲感染者一次口服雙羥萘酸噻嘧啶（30mg/Kg體重），服藥后從糞便中收集蛔蟲成蟲。取完整的蛔蟲洗凈后用含100U/ml青霉素、鏈霉素的無(wú)菌生理鹽水浸泡1

2、5分鐘，濾紙吸干，在超凈臺(tái)內(nèi)解剖蛔蟲，取出內(nèi)臟丟棄，收集蟲體，用勻漿器攪碎后，在10，000×g離心30分鐘，取上清，經(jīng)0.45μm醋酸纖維膜過(guò)濾除菌，用核酸蛋白分析儀測(cè)蛋白含量為3200μg/ml，置-30℃儲(chǔ)藏備用。 2.腫瘤細(xì)胞的篩選：小鼠Lewis肺癌細(xì)胞株（LLC）、小鼠肝癌細(xì)胞株（Hepa1-6）和小鼠淋巴瘤細(xì)胞株（EL4）均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所細(xì)胞庫(kù)。用四氮唑鹽酶還原法（microculture tetra

3、zolium test，MTT）檢測(cè)人蛔蟲提取物對(duì)三種腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，以篩選出最敏感細(xì)胞株和最佳作用濃度。 3.繪制LLC細(xì)胞生長(zhǎng)曲線：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LLC細(xì)胞常規(guī)消化，用RPMI-1640+10％FCS培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/ml，將細(xì)胞分別接種于24孔培養(yǎng)板中，1ml/孔，置37℃、5％CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天取三孔細(xì)胞進(jìn)行消化后計(jì)數(shù)，取平均值，連續(xù)觀察7d。其余細(xì)胞隔2d換液，根據(jù)所得數(shù)據(jù)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲

4、線。 4.LLC細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LLC細(xì)胞消化后，用RPMI1640+10％FCS的培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/ml，加入96孔板，100μl/孔，置37℃、5％CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，棄去孔內(nèi)液體，加入不同濃度的BEAL（起始濃度為3200μg/ml的BEAL倍比稀釋至12.5μg/ml），每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔，置37℃、5％CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24h、48h、72h。棄去孔內(nèi)液體，加入MTT，置3

5、7℃、5％CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。4h后取出，加入二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），置酶標(biāo)儀檢測(cè)OD492，取細(xì)胞存活率≥50％的BEAL濃度為誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)的起始濃度。 5.荷瘤小鼠模型的建立：將LLC細(xì)胞株擴(kuò)增后對(duì)小鼠進(jìn)行腫瘤造模：以細(xì)胞密度為1×107/ml，0.1ml/只，接種于小鼠右前肢腋下皮下。 6.實(shí)驗(yàn)分組：A組-人蛔蟲提取物事先干預(yù)組（BEAL+LLC）：腹腔注射濃度為100μg/ml

6、的BEAL，0.1ml/只，隔天一次，10d后腫瘤造模；B組-生理鹽水事先干預(yù)組（NS+LLC）：腹腔注射生理鹽水，0.1ml/只，隔天一次，10d后腫瘤造模；C組-腫瘤造模后提取物干預(yù)組（LLC+ BEAL）：以細(xì)胞密度為1×107/ml的LLC細(xì)胞懸液，0.1ml/只，接種于小鼠右前肢腋下皮下，2d后用BEAL干預(yù)，隔天一次；D組-腫瘤造模后生理鹽水干預(yù)組（LLC+NS）：以細(xì)胞密度為1×107/ml的LLC細(xì)胞懸液，0.1ml/只

7、，接種于小鼠右前肢腋下皮下，2d后用生理鹽水干預(yù)，隔天一次；E組-陰性對(duì)照組，正常飼養(yǎng)，不加任何處理。10d后處理各組小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 7.巨噬細(xì)胞的分離和培養(yǎng)：常規(guī)無(wú)菌狀態(tài)（詳細(xì)見下文）制備小鼠巨噬細(xì)胞，加入含有100U/ml青霉素、鏈霉素、10％FCS的RPMI1640培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/ml，收集于24孔培養(yǎng)板中，置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 8.脾淋巴細(xì)胞的分離和培養(yǎng)：常規(guī)無(wú)菌狀態(tài)制備小鼠脾細(xì)胞

8、，加入含有100U/ml青霉素、鏈霉素、10％FCS的RPMI1640培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/ml，收集于6孔培養(yǎng)板中，置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 9.細(xì)胞因子的表達(dá)：巨噬細(xì)胞和脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)72h后收集上清，用ELISA法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)上清中TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-10的表達(dá)。 10.LLC細(xì)胞有絲分裂指數(shù)：普通光學(xué)顯微鏡下觀察有絲分裂相細(xì)胞，取細(xì)胞數(shù)多、中、少3個(gè)區(qū)域各一區(qū)，共計(jì)數(shù)

9、1000個(gè)細(xì)胞，計(jì)算出細(xì)胞有絲分裂指數(shù)（mitotic index；MI）。 11.胸腺和脾臟指數(shù)：人蛔蟲提取物干預(yù)荷瘤小鼠，10d后取出小鼠胸腺、脾臟稱重（mg），分別除以小鼠體重（g），得到胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。 12.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：用SPSS13.0處理各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，對(duì)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±S）表示。細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為細(xì)胞殺傷率后采用方差分析（F檢驗(yàn)），HE染色計(jì)算細(xì)胞分裂指數(shù)所得數(shù)

10、據(jù)做平方根反正弦轉(zhuǎn)換，然后進(jìn)行方差分析。ELISA數(shù)據(jù)直接進(jìn)行方差分析，樣本均數(shù)的兩兩比較用q檢驗(yàn)。P<0.05表示有顯著性差異，P>0.05表示無(wú)顯著性差異。 結(jié)果： 1.腫瘤細(xì)胞的篩選：MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BEAL對(duì)LLC、Hepa1-6和EL4三種腫瘤細(xì)胞均有細(xì)胞毒作用，但以LLC細(xì)胞最為敏感，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取LLC為本實(shí)驗(yàn)的靶細(xì)胞株。 2.細(xì)胞生長(zhǎng)曲線：LLC細(xì)胞從第3d開始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在第4d生長(zhǎng)最

11、為旺盛，之后增殖減慢逐漸進(jìn)入平臺(tái)期。 3.LLC細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)：當(dāng)BEAL濃度為200μg/ml時(shí)細(xì)胞存活率為51％，因此取200μg/ml為誘導(dǎo)LLC細(xì)胞的濃度上限。 4.LLC細(xì)胞有絲分裂指數(shù)：顯微鏡下觀察，各實(shí)驗(yàn)組LLC細(xì)胞分裂指數(shù)均低于陰性對(duì)照組。在同一時(shí)間段內(nèi)，細(xì)胞分裂指數(shù)隨BEAL的濃度增加而降低，25μg/ml組的細(xì)胞分裂指數(shù)最高，800μg/ml濃度組的分裂指數(shù)最低，在同一濃度內(nèi)，細(xì)胞分裂指數(shù)隨時(shí)間延長(zhǎng)而降

12、低。 5.BEAL對(duì)荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響：所有分組中小鼠荷瘤后BEAL干預(yù)的C組抑瘤率最強(qiáng)，為33.33％，腫瘤明顯小于同時(shí)干預(yù)的D組（P<0.05）；BEAL提前干預(yù)的A組腫瘤明顯大于B組，但A組與B組比較無(wú)明顯抑瘤作用；小鼠瘤重的兩兩比較顯示，A組與B、C、D組比較均有顯著性差異，C組與D組比較也有顯著性差異，其余組間兩兩比較無(wú)顯著性差異。 6.胸腺和脾臟指數(shù)：（1）胸腺指數(shù)：A組和B組均高于陰性對(duì)照的E組，其中B

13、組與E組比較有顯著性差異，A組低于B組，且有顯著性差異；C組和D組均低于陰性對(duì)照的E組，但無(wú)顯著性差異，C組高于D組，無(wú)顯著性差異。（2）脾臟指數(shù)：A組和B組均高于陰性對(duì)照的E組，A組與E組比較有顯著性差異，A組高于B組且有顯著性差異；C組與D組均高于E組，C組與E組比較有顯著性差異，C組高于D組但無(wú)顯著性差異。 7.DNA瓊脂糖凝膠電泳：經(jīng)BEAL誘導(dǎo)后的LLC細(xì)胞，其DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)具有凋亡特征的“梯狀”條帶，而對(duì)

14、照組未見此現(xiàn)象。 8.ELISA檢測(cè)：（1）腹膜巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清中A、B、C、D組的TNF-α含量均低于E組，但無(wú)顯著性差異；A、B、C、D組的IFN-γ含量均低于E組；A組的IL-4含量高于E組，但無(wú)顯著性差異，B、C、D組的IL-4含量均低于E組，且有顯著性差異。A、B、C、D組的IL-10含量均低于E組。（2）脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中，A、B、C、D組的TNF-α含量均低于E組；A組的IFN-γ含量明顯高于E組，有顯著性差異，

15、其它各實(shí)驗(yàn)組與E組比較均無(wú)顯著性差異；A、B、C、D組的IL-4含量均低于E組，與E組比較有顯著性差異；A組的IL-10含量明顯高于E組，有顯著性差異。 結(jié)論： 1.BEAL能夠?qū)w外培養(yǎng)的LLC產(chǎn)生細(xì)胞毒作用，并能夠誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡。BEAL對(duì)細(xì)胞的抑制率在一定范圍內(nèi)呈濃度和作用時(shí)間依賴性，在同一時(shí)間段內(nèi)當(dāng)BEAL濃度增加時(shí)，抑制率升高；在同一濃度下隨BEAL作用時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制率也增加。 2.BEAL可降低LL