銀杏外種皮提取物成分分析及其抗腫瘤免疫逃逸實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　1、檢測(cè)銀杏外種皮提取物（Ginkgo biloba exocarp extracts，GBEE）中的銀杏酸和鉛(Pb)、鎘(Cd)、銅(Cu)、砷(As)和汞(Hg)5種重金屬元素含量，為評(píng)估其用藥安全性以及建立其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考;
　　2、研究GBEE抗腫瘤免疫逃逸作用，為進(jìn)一步揭示GBEE的抗腫瘤藥理學(xué)作用提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法:
　　1、GBEE成分分析
　　采集2013年江蘇泰興產(chǎn)銀

2、杏外種皮，按發(fā)明專利方法（專利號(hào):201010251050.9）制備GBEE。采用高效液相色譜法(High performance liquid chromatography，HPLC)測(cè)定銀杏酸含量;采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法(Inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS)與原子熒光光度法(Atomic fluorescence spectrometer，AFS)聯(lián)合測(cè)定Pb、

3、Cd、Cu、As和Hg5種重金屬元素含量。
　　2、GBEE抗腫瘤免疫逃逸實(shí)驗(yàn)
　　建立C57BL/6J小鼠Lewis肺癌(Lewis lung cancer，LLC)移植瘤模型，將荷瘤小鼠隨機(jī)分組，每組10只，分別為對(duì)照組和GBEE(50、100、200 mg·kg-1)低、中、高劑量組，另設(shè)不接種腫瘤細(xì)胞的正常組。實(shí)驗(yàn)過程中，動(dòng)態(tài)檢測(cè)荷瘤小鼠腫瘤體積、小鼠體重和進(jìn)食量。給藥15天后，剝離腫瘤稱取瘤質(zhì)量并計(jì)算抑瘤率;采用H

4、&E染色法觀察腫瘤組織淋巴細(xì)胞浸潤情況:采用RT-qPCR法檢測(cè)腫瘤組織Fas mRNA、Fas配體(Fasligand，F(xiàn)asL) mRNA和誘騙受體3(Decoy receptor3，DcR3) mRNA的表達(dá)量:采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠脾臟和腫瘤組織中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatoryT cell，Treg）比例;采用ELISA法檢測(cè)腫瘤組織上清轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(Transforming growth factor beta，TG

5、F-β1)的表達(dá)量。
　　結(jié)果:
　　1、成分分析結(jié)果顯示，江蘇泰興產(chǎn)銀杏外種皮經(jīng)水提醇沉法制備GBEE，得率為2.05％;HPLC法測(cè)得GBEE中不含任何銀杏酸成分;ICP-MS/AFS法測(cè)得GBEE中Pb、Cd、Cu、As和Hg的含量均在2010版《中國藥典》限量水平以下。
　　2、抗腫瘤免疫逃逸實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著腫瘤體積的增大，各組小鼠體重均有不同程度提高;與對(duì)照組比較，GBEE(50、100、200 mg·kg

6、-1)各劑量組均不同程度提高了小鼠進(jìn)食量。給藥15天后，GBEE各劑量組移植瘤質(zhì)量均明顯低于對(duì)照組(P＜0.01或P＜0.001)，抑瘤率分別為32.33％、34.79％和46.89％。H&E染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，GBEE中、高劑量組可見較多淋巴細(xì)胞浸潤于腫瘤間質(zhì);GBEE低劑量組淋巴細(xì)胞稀疏散在分布于腫瘤組織間隙。RT-qPCR結(jié)果表明，GBEE中、高劑量組可明顯上調(diào)腫瘤細(xì)胞Fas mRNA表達(dá)率（P＜0.05或P＜0.01），

7、GBEE高劑量組可顯著下調(diào)腫瘤細(xì)胞FasLmRNA表達(dá)率(P＜0.05)和DcR3 mRNA表達(dá)率(P＜0.05)。與對(duì)照組比較，GBEE各劑量組均顯著降低小鼠脾臟中Treg比例（P＜0.05或P＜0.01），GBEE中、高劑量組能顯著降低荷瘤小鼠腫瘤組織中Treg比例（P＜0.05或P＜0.01）。GBEE各劑量組均可顯著降低腫瘤組織TGF-β1表達(dá)量（P＜0.05或P＜0.01）。
　　結(jié)論:
　　1、江蘇泰興產(chǎn)GBEE