糙葉敗醬大孔吸附樹脂提取物抗腫瘤作用及其機制的實驗研究.pdf

1、目的 研究和觀察糙葉敗醬大孔吸附樹脂提取物 (Patrinia scabra Bunge extract，PsBe)的抗腫瘤作用，探討其作用機制。 方法 1、利用正交試驗法研究超聲提取糙葉敗醬總皂甙的最佳提取工藝。 2、利用D101型大孔吸附樹脂分離糙葉敗醬組份，進行多糖和皂甙含量的測定。 3、采用Sarcoma 180和Hepatoma 22腹水和實體移植腫瘤模型，觀察PsBe的抗腫瘤作用，計算

2、荷瘤小鼠生命延長率、抑瘤率，HE染色觀察Hepatoma，22實體瘤腫瘤組織形態(tài)學變化，激光共聚焦顯微鏡檢測Sarcoma 180腹水瘤細胞的DNA、RNA含量。 4、PsBe作用于Sarcoma 180腹水瘤荷瘤小鼠，計算荷瘤小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，MTT 法等檢測外周血淋巴細胞轉化功能、NK細胞活性、LAK細胞活性和B細胞產(chǎn)生抗體能力，雙抗體夾心ELISA法檢測血清Th1型(IL-2、IL-12、IFN-γ、TNF-α)和T

3、h2型(IL-6、IL-10)細胞因子水平，細胞花環(huán)實驗法檢測紅細胞C3b受體花環(huán)率、紅細胞免疫復合物花環(huán)率和紅細胞腫瘤細胞花環(huán)率，流式細胞儀檢測紅細胞膜CD35和CD44s數(shù)量。 5、PsBe作用于Sarcoma180腹水瘤荷瘤小鼠，透射電鏡和熒光顯微鏡觀察腫瘤細胞凋亡的形態(tài)學變化，Annexin V-FITC/PI雙標記法檢測腫瘤細胞早期凋亡率，瓊脂糖凝膠電泳檢測腫瘤細胞凋亡的DNA片段，RT-PCR法檢測腫瘤細胞easpa

4、se-3的基因表達情況，免疫組織化學法檢測腫瘤細胞Caspase-3的蛋白表達情況，流式細胞儀檢測腫瘤細胞P53、Bcl-2、Bax蛋白表達情況，激光共聚焦顯微鏡檢測腫瘤細胞線粒體膜電位(ΔΨm)、細胞間通訊(GJIC)、自由基含量和[Ca<'2+>]的變化。 6、運用糙葉敗醬復方扶正抑瘤顆粒(FYK)荷瘤小鼠含藥血清作用于體外培養(yǎng)Hepatoma 22腫瘤細胞，激光共聚焦顯微鏡檢測腫瘤細胞DNA、RNA含量、ΔΨm、GJIC、

5、自由基含量和[Ca<'2+>]的變化，Annexin V-FITC/PI雙標記法檢測腫瘤細胞早期凋亡率。 結果 1、糙葉敗醬總皂甙超聲提取的最佳工藝為：乙醇濃度65％，超聲提取時間40min，超聲提取溫度55℃，超聲功率210W。各種因素對總皂甙提取效果影響的權重依次為：超聲功率、乙醇濃度、超聲提取時間和超聲提取溫度。 2、糙葉敗醬水提物大孔吸附樹脂柱層析，20％乙醇洗脫液得2種組份，組份一中多糖含量54.4％，

6、皂甙含量6.8％；50％7,醇洗脫液得 4 種組份，組份一中多糖含量34.8％，皂甙含量 34.4％，組份二中多糖含量 21.4％，皂甙含量 41.8％；80％乙醇洗脫液得1種組分。 3、PsBe作用于Sarcoma 180和Hepatoma 22腹水和實體移植腫瘤模型，均有一定的抗腫瘤作用，其中以Sarcoma 180腹水瘤模型作用最佳，同時，可造成Sarcoma 180細胞DNA、RNA含量下降。HE染色可見不同程度的腫瘤細

7、胞減少，腫瘤間質內有以大量淋巴細胞為主的炎性細胞浸潤，部分呈條帶狀。 4、PsBe作用于Sarcoma 180腹水瘤荷瘤小鼠，胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)增高；外周血淋巴細胞轉化功能、NK細胞活性、LAK細胞活性和B細胞產(chǎn)生抗體能力增強；血清Th1型細胞因子水平升高，Th2型細胞因子水平降低；紅細胞C3b受體花環(huán)率和紅細胞腫瘤細胞花環(huán)率上升，紅細胞免疫復合物花環(huán)率下降，紅細胞膜CD35和CD44s數(shù)量增高。 5、PsBe作用于Sa

8、rcoma 180腹水瘤荷瘤小鼠，腫瘤細胞出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學改變，瓊脂糖凝膠電泳可見“DNA ladder”，細胞早期凋亡率升高；凋亡相關基因和蛋白caspase-3、P53、Bax表達增加，Bcl-2蛋白表達降低；腫瘤細胞ΔΨm下降，自由基含量和[Ca<'2+>]增高，GJIC功能部分恢復。 6、FYK荷瘤小鼠含藥血清作用于體外培養(yǎng)Hepatoma 22腫瘤細胞，細胞DNA、RNA含量和ΔΨm降低，細胞早期凋亡率、自由基含量