根癌農(nóng)桿菌介導的ACS反義基因轉(zhuǎn)化中國水仙研究.pdf

1、本研究以中國水仙和根癌農(nóng)桿菌菌株LBA4404為試驗材料，首次對根癌農(nóng)桿菌介導的ACS反義基因轉(zhuǎn)化中國水仙進行研究。主要內(nèi)容包括：①選擇中國水仙高頻離體再生途徑；②建立并優(yōu)化再生小鱗莖和愈傷組織兩種中國水仙轉(zhuǎn)基因受體系統(tǒng)；③采用根癌農(nóng)桿菌介導法進行ACS反義基因轉(zhuǎn)化中國水仙并優(yōu)化轉(zhuǎn)化體系；④篩選抗性小鱗莖并實現(xiàn)其植株再生；⑤對轉(zhuǎn)ACS反義基因的再生小鱗莖(切塊)和愈傷組織進行GUS瞬時表達檢測；⑥對再生植株葉片進行GUS穩(wěn)定表達檢測和g

2、us基因的PCR檢測。主要研究結(jié)果如下： 1、中國水仙高頻離體再生途徑的選擇。試驗以中國水仙鱗莖盤切塊、子房切片以及花藥等為外植體，對中國水仙離體再生途徑進行研究，初步篩選出適合的外植體及其高頻的離體再生途徑。中國水仙鱗莖在0.1％升汞+3-5滴吐溫的試驗條件下消毒效果良好，在相對優(yōu)化的培養(yǎng)基MS+5.0 mg·L-1BA+0.1 mg·L-12，4-D條件下，不同外植體直接誘導小鱗莖再生頻率高低依次是鱗莖盤切塊、子房切片和花藥

3、；在相對優(yōu)化的培養(yǎng)基MS+2.0 mg·L-12,4-D+0.1 mg·L-1BA條件下，不同外植體愈傷組織誘導頻率由高至低依次是鱗莖盤切塊、花藥和子房切片；而在相對優(yōu)化的培養(yǎng)基MS+5.0 mg·L-1BA+0.1 mg·L-12,4-D條件下，不同外植體來源的愈傷組織誘導小鱗莖再生頻率也存在顯著差異，其中鱗莖盤切塊來源的再生頻率最高，而子房切片和花藥來源的則依次之。 2、中國水仙轉(zhuǎn)基因受體系統(tǒng)的建立及優(yōu)化。根據(jù)中國水仙高頻離

4、體再生途徑的選擇結(jié)果并綜合考慮再生頻率和浸染效果，試驗建立再生小鱗莖(切塊)以及愈傷組織作為根癌農(nóng)桿菌介導ACS反義基因轉(zhuǎn)化中國水仙的受體系統(tǒng)。100 mg·L-1和110 mg·L-1卡那霉素濃度分別適合于小鱗莖切塊以及愈傷組織進行轉(zhuǎn)化操作的篩選抗生素濃度，而頭孢霉素濃度范圍在0-300 mg·L-1時，小鱗莖切塊、愈傷組織小鱗莖分化率均穩(wěn)定高于80.00％。在中國水仙遺傳轉(zhuǎn)化過程中，9-10月、11-12月以及次年1-3月這3個接種

5、時期均適于轉(zhuǎn)化操作；較優(yōu)生長調(diào)節(jié)劑組合為中濃度(5.0 mg·L-1)BA附加低濃度(0.1 mg·L-1)2,4-D，適合于小鱗莖切塊受體系統(tǒng)的高頻率穩(wěn)定再生，而影響愈傷組織受體系統(tǒng)小鱗莖再生的主次因子分別是KT、2,4-D以及BA，其中附加高濃度的KT(5.0 mg·L-1)、中高濃度(2.0 mg·L-1)的BA以及低濃度(0.1 mg·L-1)的2,4-D的組合效果最佳，其小鱗莖分化率比優(yōu)化前提高了近6.00％，且其有效繁殖系數(shù)

6、仍保持在12.00以上；試驗選擇的小鱗莖切塊受體系統(tǒng)的繼代周期為30 d，愈傷組織受體系統(tǒng)的繼代周期為15 d；1/2小鱗莖(外緣有微縱切)微切處理較適合小鱗莖切塊受體系統(tǒng)以用于浸染轉(zhuǎn)化操作，而愈傷組織受體系統(tǒng)經(jīng)細胞學觀察研究分析具有較強的分化和再生能力，遺傳穩(wěn)定性良好。 3、農(nóng)桿菌介導的ACS反義基因轉(zhuǎn)化中國水仙。在前述研究基礎上，試驗對農(nóng)桿菌介導的中國水仙兩種受體系統(tǒng)的遺傳轉(zhuǎn)化新策略進行研究，相關較適技術(shù)參數(shù)顯示，相同之處表

7、現(xiàn)在稀釋液均為1/2 MS液體培養(yǎng)基，農(nóng)桿菌活化物均為添加一定濃度的葡萄糖，共培養(yǎng)時間均為4 d，共培養(yǎng)溫度均為25℃以及共培養(yǎng)培養(yǎng)基pH值均為5.8等；不同之處則表現(xiàn)在預培養(yǎng)時間前者為6d而后者為10d，前處理方式前者為局部針刺而后者為局部針刺+風干30 min，農(nóng)桿菌重懸液濃度OD600值前者為0.5而后者為0.3，重懸液中添加的蔗糖濃度前者為100 g·L-1而后者為80 g·L-1，浸染液前者為重懸液而后者為重懸液+石英砂以及浸

8、染時間前者為20 min而后者為15 min等。浸染后的兩種受體系統(tǒng)在除菌時均采用含有300 mg·L-1的頭孢霉素的無菌水來除菌。 4、抗性小鱗莖的篩選、植株再生及檢測。小鱗莖切塊和愈傷組織篩選過程中，間歇篩選方式的抗性小鱗莖分化率較高，而逐步加壓、直接篩選方式則依次之。而小鱗莖切塊和愈傷組織分化的抗性小鱗莖GUS穩(wěn)定表達檢測中，直接篩選方式抗性小鱗莖陽性率較高，而逐步加壓、間歇篩選方式則依次之。總體而言，愈傷組織受體系統(tǒng)的抗