農(nóng)桿菌介導(dǎo)sbe Ⅱb基因RNA干涉片段轉(zhuǎn)化玉米自交系的研究.pdf

1、玉米是重要的糧食、飼料與工業(yè)原料作物,長期以來,玉米優(yōu)良基因型高效再生體系的建立一直是人們研究的熱點(diǎn)。淀粉是玉米籽粒中最主要的成分,隨著玉米淀粉在能源、化工和材料等工業(yè)上的廣泛應(yīng)用,改良玉米淀粉品質(zhì)已成為近年來一個(gè)十分重要的目標(biāo)。RNA干涉是一種重要的基因沉默方式,在植物基因功能和遺傳改良研究中廣泛應(yīng)用。為進(jìn)一步篩選和建立優(yōu)良玉米自交系的再生和遺傳轉(zhuǎn)化體系,探討RNAi技術(shù)在玉米淀粉品質(zhì)改良中的應(yīng)用效果,建立玉米R(shí)NAi的分子育種新方法

2、。本文以玉米幼胚為外植體,較系統(tǒng)地研究了七個(gè)常規(guī)優(yōu)良自交系的再生體系、農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化體系,構(gòu)建了玉米淀粉分支酶sbe Ⅱb基因的RNAi表達(dá)載體,開展農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米遺傳轉(zhuǎn)化,并對(duì)轉(zhuǎn)化株進(jìn)行了分子驗(yàn)證,獲得了如下主要結(jié)果： 1.選用了生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用的7個(gè)玉米優(yōu)良自交系,通過組織培養(yǎng)研究其再生情況,玉米自交系基因型間的培養(yǎng)能力具有較大的差異,7個(gè)玉米自交系幼胚都能誘導(dǎo)出初級(jí)愈傷組織。但是,形成胚性愈傷組織的能力上具有很大的差異

3、,其中4個(gè)自交系178、R18紅、綜3、高油116可以形成胚性愈傷組織,178誘導(dǎo)率最高為78％。 2.通過LS、N6B5、MB、MS四種誘導(dǎo)培養(yǎng)基的研究,確定了178幼胚最佳誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基為LS+2,4-D 2.0 mg/L+-L-pro 700 mg/L+CH 500 mg/L+3％蔗糖。通過研究,獲得了玉米幼胚的最合適誘導(dǎo)、繼代、分化和生根等一系列培養(yǎng)基和培養(yǎng)程序,建立了最高再生率為96％的以幼胚為外植體的高頻再生體系

4、。 3.采用正交試驗(yàn)法和GUS染色方法,對(duì)幼胚農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化中的菌液OD值、侵染時(shí)間、AS濃度、共培養(yǎng)時(shí)間等4因素進(jìn)行了優(yōu)化,適宜的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化參數(shù)為菌液OD_(600)值為0.6、浸染時(shí)間為30 min、AS濃度為200 μmol/L和共培養(yǎng)時(shí)間為2 d。通過將篩選培養(yǎng)分三輪進(jìn)行,潮霉素濃度分別為3 mg/L、5 mg/L、5 mg/L,優(yōu)化了抗性愈傷篩選程序。對(duì)轉(zhuǎn)化的愈傷組織分化誘導(dǎo)出苗后進(jìn)行PCR檢測,轉(zhuǎn)化率最高達(dá)到1

5、.8％。初步建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米遺傳轉(zhuǎn)化體系。 4.利用‘pCAMBIA 1301+Glu和pCAMBIA 1300+HMW+2F作為橋梁載體,成功地構(gòu)建了表達(dá)型雙片段干涉載體pCAMBIA 1301+Glu+2F,含有胚乳特異性啟動(dòng)子(麥谷蛋白Glu啟動(dòng)子),sbe Ⅱb基因16、20外顯子的雙干涉片段和潮霉素抗性基因選擇標(biāo)記。利用凍融法將構(gòu)建的干涉載體直接導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105中,該轉(zhuǎn)化菌可用于下-步的玉米遺傳轉(zhuǎn)化。

6、 5.干涉表達(dá)載體pCAMBIA.1301+Glu+2F采用優(yōu)化的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米遺傳轉(zhuǎn)化體系轉(zhuǎn)入玉米自交系178,并對(duì)移栽成活的5株玉米自交系178的再生植株進(jìn)行PCR檢測,初步證明sbe Ⅱb仍基因RNAi片段已整合到玉米基因組中。綜上所述,本文通過對(duì)7個(gè)常規(guī)優(yōu)良自交系再生能力和條件的研究,篩選并優(yōu)化了178自交系幼胚的高頻再生體系,優(yōu)化并建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米遺傳轉(zhuǎn)化體系。成功構(gòu)建了一個(gè)用于玉米直鏈淀粉品質(zhì)改良的RNAi表達(dá)載體