農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米Rf4恢復(fù)基因的遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、玉米作為重要的糧食作物之一，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和國民經(jīng)濟發(fā)展中具有十分重要的作用。用轉(zhuǎn)基因的方法導(dǎo)入優(yōu)良基因是創(chuàng)造玉米新種質(zhì)和功能驗證的有效手段之一，在玉米遺傳學(xué)研究和育種中得到了廣泛應(yīng)用。細胞質(zhì)雄性不育是作物雜種優(yōu)勢利用的一種主要途徑，玉米C型胞質(zhì)雄性不育因其育性穩(wěn)定成為目前生產(chǎn)上利用的一種主要胞質(zhì)類型。課題組前期利用圖位克隆的方法對玉米C型胞質(zhì)雄性不育的恢復(fù)基因Rf4進行了克隆，本試驗擬以玉米幼胚胚性愈傷再生體系為基礎(chǔ)，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進行f

2、4基因的遺傳轉(zhuǎn)化，并獲得抗性植株，進行基因功能驗證，并建立一套穩(wěn)定、高效的轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系。
　　試驗以多種基因型幼胚為材料，進行胚性愈傷組織的誘導(dǎo)及再生，對轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的建立進行了探討，研究了影響轉(zhuǎn)化過程的多個因素，并用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化了f4基因。主要研究結(jié)果如下:
　　1、以自交系綜3、87-1、HIIA和雜交組合87-1×綜3、綜3×87-1、87-1×HIIA基因型的材料進行了受體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的探討。結(jié)果表明:不同基因型玉

3、米幼胚，胚性愈傷誘導(dǎo)率差異性很大。其中，雜交組合綜3×87-1和87-1×HIIA的愈傷誘導(dǎo)率和胚性愈傷誘導(dǎo)率相對較高，分別達97.5％、65.5％和98.4％、70.9％;而87-1和87-1×綜3的胚性愈傷誘導(dǎo)率則較低，最低只有20.2％;綜3和HIIA的愈傷誘導(dǎo)能力中等。因此，綜3、HIIA、綜3×87-1和87-1×HIIA都可以作為良好的受體材料。試驗還表明，胚齡和幼胚大小對愈傷誘導(dǎo)率具有一定的影響，幼胚大小在1.0-2.0m

4、m之間最適合誘導(dǎo)愈傷組織，但不同基因型幼胚達到1.0-2.0mm大小的胚齡有差異。在培養(yǎng)基配方方面，2，4-D濃度為1-2mg/L時比較有利于愈傷的誘導(dǎo)，6-BA濃度為1.0mg/L時愈傷的成苗分化率最高，而再生植株生根壯苗最適合的NAA濃度是0.6mg/L。
　　2、以綜3×87-1愈傷為受體材料進行的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化結(jié)果表明，菌液濃度OD600為0.6，侵染時間10min，共培養(yǎng)溫度為22℃，共培養(yǎng)3天的轉(zhuǎn)化效果最好。試驗還確定

5、了該材料的PPT臨界篩選濃度為8mg/L，此濃度比較有利于抗性愈傷的篩選。
　　3、利用建立的遺傳轉(zhuǎn)化體系，對Rf4基因過表達載體和RNAi載體進行了遺傳轉(zhuǎn)化。共獲得656株轉(zhuǎn)基因苗，用標記基因Bar和終止子NOS引物進行PCR檢測有10株呈陽性，初步認為根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒上攜帶目的基因(Rf4基因)的T-DNA已經(jīng)被導(dǎo)入。其中RNAi載體轉(zhuǎn)化的6株陽性植株得到了種子。T1和T2代的分子檢測和育性調(diào)查結(jié)果顯示，Rf4恢復(fù)基因的RA