鵝細(xì)小病毒Taq Man熒光定量PCR方法的建立及初步應(yīng)用.pdf

1、鵝細(xì)小病毒病(Goose parvovirusis，GP)是由鵝細(xì)小病毒(Goose parvovirus，GPV)感染易感動(dòng)物，引起易感動(dòng)物患病的一種傳染性極高的疫病，又名小鵝瘟，該疫病的特點(diǎn)是傳播速度極快，感染率、發(fā)病率和死亡率高，給養(yǎng)鵝業(yè)帶來(lái)了重創(chuàng)，嚴(yán)重影響了我國(guó)養(yǎng)鵝業(yè)的發(fā)展。
　　預(yù)防和控制GP，早期診斷是關(guān)鍵，現(xiàn)階段對(duì)GPV的檢測(cè)主要采用普通PCR方法。但是普通PCR方法與Taq Man熒光定量PCR方法相比，其不能定量

2、檢測(cè)GPV的病毒載量，只能定性診斷GP，對(duì)病情的嚴(yán)重程度不能做出準(zhǔn)確判斷，不能給該病的預(yù)防和治療提供精準(zhǔn)依據(jù)。因此，本研究擬建立一種快速、精確、絕對(duì)定量的鵝細(xì)小病毒Taq Man熒光定量PCR檢測(cè)方法。根據(jù)GenBank已發(fā)表的GPV-VP3基因序列(JN836326)，在保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)合成了一對(duì)特異性引物和探針，將擴(kuò)增到的部分VP3目的基因(120bp)進(jìn)行TA克隆，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)粒，將其作為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品，然后對(duì)探針濃度、引物濃度和退火溫度

3、等反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化篩選，并進(jìn)行敏感性、特異性和重復(fù)性等試驗(yàn)。結(jié)果顯示，通過(guò)Taq Man熒光定量PCR反應(yīng)得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，從曲線可知，反應(yīng)中模板DNA的量與Taq Man熒光定量PCR的Ct值成線性關(guān)系，其中相關(guān)系數(shù)為0.999。此方法對(duì)GPV的最低檢出率濃度為109個(gè)倍比稀釋度。與普通PCR比較，靈敏度高出100倍。與鴨瘟病毒(DEV)、犬細(xì)小病毒(CPV)、新城疫病毒(NDV)和鵝副黏病毒(GPMV)的核酸均不發(fā)生交叉反應(yīng);組內(nèi)和組間