檢測(cè)日本腦炎病毒移碼蛋白抗體的間接ELISA方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、日本腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）是一種單股正鏈RNA病毒，可以引起公豬睪丸炎和母豬流產(chǎn)，是一種人畜共患病病毒，蚊子叮咬帶毒豬后可將病毒傳播給人。JEV主要蛋白有核心蛋白C，膜蛋白PrM/M和囊膜蛋白E，以及（NS1,NS2A，NS2B,NS3,NS4A，NS4B和NS5）七個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白。NS2A基因在翻譯過程中會(huì)因?yàn)楹颂求w-1移碼產(chǎn)生衍生物，與NS1蛋白C端融合，產(chǎn)生NS1'蛋白。JEV致弱

2、株SA14-14-2由于NS2A基因的66位核苷酸由G變?yōu)锳，無法形成核糖體移碼所需的結(jié)構(gòu)，因此失去了產(chǎn)生NS1'的能力。理論上NS1'抗體是JEV野毒感染的特征指標(biāo)。本研究利用人工合成的純度為95％的NS1'44aa建立檢測(cè)豬日本腦炎病毒抗體的間接ELISA方法，并對(duì)華東地區(qū)2013年的豬群進(jìn)行血清流行病學(xué)調(diào)查。同時(shí)，根據(jù)臨床檢測(cè)數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物模型對(duì)NS1'多肽的檢測(cè)對(duì)象進(jìn)行分析，通過基因重組技術(shù)獲得重組EDⅢ和Cap串聯(lián)蛋白，利用

3、制備的EDⅢ多克隆抗體和Cap多克隆抗體對(duì)串聯(lián)蛋白進(jìn)行鑒定。發(fā)現(xiàn)其與Cap蛋白存在交叉表位。具體內(nèi)容如下:
　　1.檢測(cè)豬血清中日本腦炎病毒移碼蛋白抗體的間接ELISA檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用
　　本研究以人工合成的純度為95％的NS1'44aa多肽為檢測(cè)抗原，包被ELISA酶標(biāo)板，建立間接ELISA抗體檢測(cè)方法，對(duì)各項(xiàng)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，并確定其臨界值，同時(shí)進(jìn)行特異性，敏感性及重復(fù)性試驗(yàn)。所建立的ELISA優(yōu)化條件為:抗原最適包

4、被量為0.5ug/ml，待見血清稀釋度為1∶100，包被時(shí)間為37℃2h后4℃12h，最佳封閉液為1％BSA，一抗作用時(shí)間為1.5h，HRP標(biāo)記的羊抗豬二抗稀釋度為1∶5000，二抗作用時(shí)間為1h，顯色時(shí)間為10min，臨界值為OD450≥0.286判為陽(yáng)性，OD450nm≤0.238判為陰性，介于二者之間為可疑。與PRV、PRRSV、PCV2、CSFV和FMDV等抗體陽(yáng)性血清無交叉反應(yīng)，批間和批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)較好。根據(jù)獸用生物制品試驗(yàn)研

5、究技術(shù)指導(dǎo)原則，利用建立的ELISA方法對(duì)接種JEV NJ08株的小鼠進(jìn)行抗體檢測(cè)，并與實(shí)驗(yàn)室已建立的JEV EDⅢ間接ELISA方法進(jìn)行比對(duì)，以驗(yàn)證該方法檢測(cè)臨床動(dòng)物血清的可行性。利用該方法對(duì)華東地區(qū)2292份臨床豬血清進(jìn)行了檢測(cè)，陽(yáng)性率為73.1％，其中測(cè)得母豬血清154份，132份為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為86.1％，商品豬血清638份，432份為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為67.8％，為JEV診斷和流行病學(xué)調(diào)查奠定了良好的基礎(chǔ)。因此，檢測(cè)JEV移碼蛋白

6、的間接ELISA存在非特異性反應(yīng)，JEV多聚蛋白可能存在與NS1'交叉的抗原表位。
　　2.日本腦炎病毒核心蛋白基因與EDⅢ基因串聯(lián)表達(dá)與鑒定
　　經(jīng)軟件分析JEV的Cap蛋白可能與NS1'蛋白存在交叉表位，在嘗試不同的載體和宿主菌未能獲得全長(zhǎng)的Cap蛋白后，將Cap蛋白分段進(jìn)行表達(dá)。PCR擴(kuò)增JEV的Cap基因的1-81bp和241-347bp，將其分別克隆至pET-32a載體，將鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pET32a-Ca

7、p-a和pET32a-Cap-b，轉(zhuǎn)化到Rosetta感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，蛋白以上清形式存在，SDS-PAGE電泳后，將包含C-b蛋白的膠帶切下，研磨后用PBS混勻，與人工合成的Cap1-27aa混合后免疫新西蘭大白兔制備JEV Cap多克隆抗體，對(duì)抗體進(jìn)行IFA鑒定。誘導(dǎo)表達(dá)JEV EDⅢ蛋白，將包含目的蛋白的膠帶切下，研磨后用PBS混勻，免疫新西蘭大白兔制備JEV EDⅢ多克隆抗體，對(duì)抗體進(jìn)行IFA鑒定。采用SOE-

8、PCR方法擴(kuò)增JEV的EDⅢ和Cap基因，將其克隆至pET-28a載體，將鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pET28a-EDⅢ-Cap，轉(zhuǎn)化到Rosseta感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后收集菌液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，原核表達(dá)產(chǎn)物大小約為29KDa。將誘導(dǎo)表達(dá)的EDⅢ-Cap串聯(lián)蛋白經(jīng)梯度尿素洗滌后進(jìn)行一步法純化復(fù)性，將所得到的復(fù)性后的EDⅢ-Cap蛋白進(jìn)行Western-blotting分析，表達(dá)的蛋白能夠與His-Tag單克隆抗體反應(yīng)，能

9、夠與制備的JEV EDⅢ多克隆抗體反應(yīng)，能夠與制備的JEV Cap多克隆抗體反應(yīng)。綜上所述，本研究利用重組EDⅢ蛋白制備了JEV EDⅢ多克隆抗體，利用重組Cap蛋白的C端及人工合成的N端制備了JEV Cap多克隆抗體，制備的EDⅢ-Cap串聯(lián)蛋白經(jīng)NI-NTA柱一步法純化復(fù)性后，能夠與JEV EDⅢ多克隆抗體及JEVCap多克隆抗體反應(yīng)，具備良好的反應(yīng)原性。
　　3.日本腦炎病毒NS1'蛋白與核心蛋白交叉表位的分析
　　J

10、EV SA14-14-2由于NS2A基因的66位核苷酸由G變?yōu)锳，無法形成核糖體移碼所需的結(jié)構(gòu)，因此失去了產(chǎn)生NS1'的能力，故我們所建立的NS1'間接ELISA方法理應(yīng)是檢測(cè)非疫苗免疫即野毒感染所產(chǎn)生的抗體，但根據(jù)第一章的數(shù)據(jù)顯示，NS1'間接ELISA與商品化試劑盒的檢測(cè)結(jié)果一致，并沒有起到區(qū)分疫苗株免疫與野毒感染的作用，而且高達(dá)73.1％的陽(yáng)性率也讓我們質(zhì)疑豬群自然感染日本腦炎的幾率，為此，我們選擇了JEV SA14-14-2株免

11、疫小鼠，按照不同的時(shí)間點(diǎn)采血分離血清，利用實(shí)驗(yàn)室建立的EDⅢ間接ELISA和本研究所建立的NS1'間接ELISA對(duì)免疫疫苗株的小鼠血清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示兩種ELISA方法檢測(cè)結(jié)果一致，根據(jù)以上數(shù)據(jù)，我們認(rèn)為NS1' ELISA的檢測(cè)對(duì)象并非野毒感染產(chǎn)生的NS1'抗體，通過生物信息學(xué)方法對(duì)NS1'的44aa進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與JEV NS5區(qū)域存在同源的氨基酸，以NS1'44aa多肽為模板，進(jìn)行突變，合成了三條新的多肽，命名為NS1'-1，

12、NS1'-2，NS1'-3，三條多肽分別含有不同的突變位點(diǎn)，但檢測(cè)結(jié)果顯示其與NS1'檢測(cè)結(jié)果一致。利用第二章所表達(dá)鑒定的EDⅢ-Cap串聯(lián)蛋白作為檢測(cè)抗原，與獲得的4株NS1'單抗進(jìn)行WB反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EDⅢ-Cap能夠與4D4單抗反應(yīng)，且產(chǎn)生特異的條帶，而對(duì)照組EDⅢ蛋白作為檢測(cè)抗原則不反應(yīng)，即說明NS1'44aa與JEV Cap蛋白可能存在交叉表位，也解釋了第一章中利用NS1'44aa建立的間接ELISA方法的NS1'陽(yáng)性率偏高的