綿羊邊界病病毒的分離鑒定與抗體間接ELISA檢測方法的建立.pdf

1、邊界病是一種在羊群中廣泛存在的病毒性疾病，該病以表現(xiàn)多種繁殖障礙性癥狀，如母羊不孕、流產(chǎn)、產(chǎn)死胎以及新生羔羊“長毛搖擺病”等而受到人們的關(guān)注，邊界病病毒（border disease virus，BDV）為邊界病的重要病原體。該病1959年爆發(fā)于英格蘭和威爾士邊界地區(qū)，之后在英國、美國、加拿大、西班牙、荷蘭、瑞典、日本等國迅速傳播開來，給世界養(yǎng)羊業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。我國之前沒有關(guān)于邊界病流行的研究報(bào)道，直至2013年才首次從持續(xù)性腹瀉山

2、羊中分離鑒定出 BDV，證實(shí)邊界病在我國的存在，開啟了我國邊界病研究的開端。隨后對(duì)江蘇省部分地區(qū)羊場展開邊界病感染監(jiān)測，初步篩選出一只疑似BDV感染綿羊。本研究針對(duì)此疑似病例，進(jìn)行了病毒的分離鑒定以及檢測方法的研究，具體研究內(nèi)容如下：
　　1.綿羊邊界病病毒的分離鑒定與基因組序列分析
　　通過對(duì)疑似血清樣品進(jìn)行瘟病毒RT-PCR篩檢，利用MDBK細(xì)胞分離培養(yǎng)，并結(jié)合電鏡觀察和BDV特異性Npro基因RT-PCR技術(shù)，鑒定分離

3、病原。隨后采用RT-PCR方法分段擴(kuò)增分離毒株全基因組序列，通過基因組序列比對(duì)和5‘-UTR、Npro基因系統(tǒng)進(jìn)化分析，確定分離毒株分類地位以及與外國BDV分離株的親緣關(guān)系，并通過人工感染試驗(yàn)，觀察試驗(yàn)羊發(fā)病情況，以衡量該毒株的致病能力。結(jié)果顯示，從疑似BDV感染綿羊血清中分離鑒定出一株ncp型BDV，命名為JSLS12-01?；蚪M測序獲得分離毒株基因組全長為12227bp(Genbank登錄號(hào)：KC963426)，兩端5‘-UTR和

4、3‘-UTR大小分別為278bp和255bp?；蚪M核苷酸和氨基酸序列比對(duì)顯示該分離株與已有 BDV參考毒株核苷酸同源性為72.3％-80.4%，氨基酸同源性在80.1%-89.7%之間。5‘-UTR和Npro基因序列系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，JSLS12-01毒株與德國源毒株 Gifhorn、中國山羊源分離株AH12-01和AH12-02親緣關(guān)系最近，屬于BDV3亞型。臨床監(jiān)測中，被檢綿羊血清病毒核酸檢測持續(xù)陽性，抗體始終為陰性，為持續(xù)性感染

5、病例；同齡羊?qū)Ρ扔^察可見該羊體型瘦小，生長速度明顯緩慢。人工感染試驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組未見明顯發(fā)病，僅在感染后1-7d出現(xiàn)病毒血癥，隨后血清中和抗體滴度開始升高。研究結(jié)果表明，JSLS12-01毒株基因組序列和5‘-UTR、Npro基因與國外BDV毒株具有較大差異性，提示國內(nèi)BDV毒株可能具有獨(dú)特的進(jìn)化模式和方向。
　　2. BDV E2蛋白間接ELISA檢測方法的建立
　　比對(duì)分析E2基因片段的抗原性、疏水性，設(shè)計(jì)擴(kuò)增E2基因的特

6、異性引物，RT-PCR擴(kuò)增后，將目的片段克隆到pET-32α，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-32α-E2，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中誘導(dǎo)表達(dá)，借助SDS-PAGE電泳分析和western-blot鑒定重組蛋白的表達(dá)情況與免疫活性。將已純化的重組蛋白作為包被抗原，構(gòu)建間接ELISA檢測方法，經(jīng)反應(yīng)條件的優(yōu)化，確定最優(yōu)反應(yīng)條件。利用間接ELISA方法和商品化BDV抗體試劑盒、western-blot分析對(duì)187份血清樣品進(jìn)行檢測，比較結(jié)果的敏感性和特

7、異性，并應(yīng)用該ELISA方法對(duì)批量臨床血清樣品進(jìn)行檢測。SDS-PAGE電泳分析和western-blot鑒定結(jié)果顯示，本研究成功表達(dá)了E2重組蛋白且具有良好的免疫原性。通過反應(yīng)條件的優(yōu)化，最終確定間接 ELISA方法的最佳抗原包被濃度為4ug/mL，20g/L BSA進(jìn)行封閉，血清1:50倍稀釋后作用1h，兔抗山羊 IgG-HRP1:30000稀釋作用45min，最后 TMB顯色10min。與商品化BDV抗體檢測試劑盒和western

8、-blot檢測相比，所建立ELISA檢測方法敏感性和特異性分別為76.25%、73.83%和61.54%、87.10%。應(yīng)用建立的ELISA方法對(duì)江蘇省部分羊場307份血清樣品進(jìn)行 BDV抗體檢測，結(jié)果顯示總陽性率為41.37%。結(jié)果表明：誘導(dǎo)表達(dá)的E2重組蛋白具有良好的抗原性，將其作為包被抗原，建立的間接ELISA檢測方法特異性較好，變異性也較小。與商品化BDV抗體檢測試劑盒和western-blot相比，有較高的符合率。關(guān)于國內(nèi)山羊