FBXW7新的靶蛋白ENO1的鑒定及功能研究.pdf

1、研究背景：
　　FBXW7也稱 FBW7，是 F-box蛋白家族成員，為SCF(Skp-Cullin-F-box)泛素連接酶體系的靶蛋白識(shí)別組分。人FBXW7基因定位于4號(hào)染色體(4q31.3)，其表達(dá)產(chǎn)物FBXW7的F-box基序和SKP1直接結(jié)合，形成SCFFBXW7復(fù)合體，并通過(guò)其WD40結(jié)構(gòu)域識(shí)別特異性底物，介導(dǎo)靶底物的泛素化降解。FBXW7可靶向降解多種癌蛋白，如Cyclin E、c-Myc、mTOR、Notch1、HI

2、F-1α等，在細(xì)胞周期進(jìn)程、細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、細(xì)胞凋亡、腫瘤轉(zhuǎn)移、腫瘤抗藥性等多個(gè)方面發(fā)揮重要調(diào)控作用。FBXW7是公認(rèn)的腫瘤抑制基因，在多種腫瘤中包括肺癌、胃癌、前列腺癌等存在功能性突變、缺失或表達(dá)降低。目前，F(xiàn)BXW7抑制腫瘤的機(jī)制尚不完全清楚，而其通過(guò)調(diào)控特定靶蛋白的含量參與腫瘤抑制作用是最常見的機(jī)制。迄今為止，已經(jīng)鑒定的FBXW7底物比較局限，而FBXW7作用的靶底物不同，其抑癌機(jī)制也不同。因此，發(fā)現(xiàn)、鑒定FBXW7未知的靶底物，

3、研究其與靶底物的作用方式，對(duì)進(jìn)一步明確FBXW7的抑癌機(jī)制有非常重要的意義，同時(shí)也為闡明FBXW7與其他腫瘤相關(guān)基因的調(diào)控及其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用奠定基礎(chǔ)。
　　烯醇酶1(enolase1，ENO1)是糖酵解過(guò)程中催化2-磷酸甘油酸形成磷酸烯醇丙酮酸的代謝關(guān)鍵酶，最終促進(jìn)乳酸及ATP的生成。多項(xiàng)研究表明，除了參與糖酵解過(guò)程外，ENO1是體內(nèi)重要的多功能蛋白，參與細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控、缺氧耐受、自身免疫調(diào)節(jié)等多種生理過(guò)程?，F(xiàn)有的研究報(bào)道E

4、NO1在鼻咽癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等多種腫瘤中表達(dá)增高，且其表達(dá)水平的高低和腫瘤的發(fā)展及不良預(yù)后有關(guān);在細(xì)胞中過(guò)表達(dá)ENO1能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖，侵襲和轉(zhuǎn)移，表明ENO1可能作為一個(gè)癌蛋白促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。然而，目前對(duì)于ENO1的具體表達(dá)調(diào)控機(jī)制尚不清楚。
　　我們?cè)谇捌谘芯恐幸院Y選鑒定FBXW7的靶蛋白為研究目標(biāo)，利用二維聚丙烯酰胺凝膠電泳(2-DE)與質(zhì)譜技術(shù)(MS)分離鑒定FBXW7基因敲除大腸癌細(xì)胞系HCT116 FBXW7-/-和

5、FBXW7野生型HCT116 FBXW7+/+中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)體外敲除大腸癌細(xì)胞FBXW7的表達(dá)可明顯上調(diào)ENO1的表達(dá)，提示ENO1可能是FBXW7新的靶底物。本研究進(jìn)一步從體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和人結(jié)直腸癌組織標(biāo)本兩個(gè)層面深入探討了FBXW7對(duì)ENO1的調(diào)控作用及調(diào)控機(jī)理，該研究的完成發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)了新的FBXW7靶蛋白，揭示了FBXW7參與腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程的新機(jī)制，為腫瘤的診斷和治療提供新的思路和靶點(diǎn)。
　　研究目的：

6、　　探討FBXW7對(duì)ENO1表達(dá)的調(diào)控作用及作用機(jī)理，并進(jìn)一步闡明FBXW7通過(guò)調(diào)控ENO1影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。
　　研究方法：
　　1.在多個(gè)細(xì)胞系及臨床組織標(biāo)本中確定FBXW7對(duì)ENO1的調(diào)控作用
　　1)在FBXW7野生型結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116 FBXW7+/+和DLD-1 FBXW7+/+及利用同源重組技術(shù)建立的FBXW7基因敲除的HCT116 FBXW7-/-和DLD-1 FBXW7-/-細(xì)胞中，應(yīng)用qRT

7、-PCR和Western blotting檢測(cè)ENO1的表達(dá)。
　　2)在前列腺癌細(xì)胞系PC3、Du145和乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-468中，通過(guò)RNA干擾技術(shù)建立FBXW7沉默表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞系，應(yīng)用qRT-PCR和Western blotting檢測(cè)ENO1的表達(dá)。
　　3)在HCT116 FBXW7-/-和HEK293細(xì)胞中轉(zhuǎn)染FBXW7真核表達(dá)載體，Western blotting檢測(cè)ENO1的表達(dá)。
　　4)

8、收集50例結(jié)直腸癌及癌旁組織，免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)FBXW7和ENO1的表達(dá)，分析兩者的相關(guān)性。
　　2.進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)確定FBXW7調(diào)控ENO1蛋白水平的機(jī)理
　　1)運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)檢測(cè)FBXW7和ENO1之間的相互作用。
　　2)在HCT116 FBXW7+/+和FBXW7-/-細(xì)胞中，應(yīng)用放線菌酮示蹤實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FBXW7對(duì)ENO1半衰期的影響。
　　3)應(yīng)用蛋白酶體抑制劑MG132處理HCT116 FB

9、XW7+/+和FBXW7-/-細(xì)胞，Western blotting檢測(cè)ENO1水平的改變。
　　4)應(yīng)用GSK3β特異的抑制劑GSK3β inhibitorⅧ處理HCT116FBXW7+/+和FBXW7-/-細(xì)胞，Western blotting檢測(cè)ENO1水平的改變。
　　5)運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)檢測(cè)FBXW7表達(dá)變化對(duì)ENO1的泛素化水平的影響。
　　3.檢測(cè)FBXW7調(diào)節(jié)ENO1的功能進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖和遷

10、移
　　1)應(yīng)用ENO1特異的干擾RNA沉默HCT116 FBXW7+/+和FBXW-/-細(xì)胞中ENO1的表達(dá)，qRT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞中CCL20 mRNA的表達(dá)。
　　2)應(yīng)用ENO1特異的干擾RNA沉默HCT116 FBXW7+/+和FBXW-/-細(xì)胞中ENO1的表達(dá)，ATP及乳酸檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ATP及乳酸的含量，檢測(cè)FBXW7調(diào)控ENO1對(duì)細(xì)胞糖酵解代謝途徑的影響。
　　3)在ENO1過(guò)表達(dá)的HCT11

11、6 FBXW7+/+細(xì)胞中過(guò)表達(dá)FBXW7或在FBXW7敲除的HCT116 FBXW7-/-細(xì)胞中沉默ENO1的表達(dá)，運(yùn)用MTT和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FBXW7調(diào)控ENO1對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖和遷移的影響。
　　研究結(jié)果：
　　1.FBXW7顯著下調(diào)ENO1蛋白的表達(dá)
　　1) Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示FBXW7基因敲除或沉默的細(xì)胞系中ENO1蛋白的表達(dá)顯著增加，而qRT-PCR結(jié)果顯示FBXW7基因敲除或沉默的

12、細(xì)胞系中ENO1 mRNA的表達(dá)沒(méi)有顯著性差異。
　　2) Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示在293T和HCT116FBXW7-/-細(xì)胞中過(guò)表達(dá)FBXW7，ENO1蛋白表達(dá)顯著降低。
　　3)免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示結(jié)腸癌組織中FBW7和ENO1水平成明顯的負(fù)相關(guān)。
　　2.FBXW7促進(jìn)ENO1通過(guò)蛋白酶體途徑降解
　　1)蛋白質(zhì)免疫共沉淀檢測(cè)結(jié)果顯示FBXW7和ENO1存在相互結(jié)合的作用。

13、　　2)放線菌酮示蹤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示FBXW7缺失延長(zhǎng)ENO1蛋白的半衰期，F(xiàn)BXW7促進(jìn)ENO1降解。
　　3) Western blotting結(jié)果顯示蛋白酶體抑制劑MG132和GSK3β inhibitorⅧ阻斷FBXW7缺失誘導(dǎo)的ENO1的表達(dá)升高。
　　4)蛋白質(zhì)免疫共沉淀檢測(cè)顯示FBXW7可以促進(jìn)ENO1的泛素化。
　　3.FBXW7調(diào)節(jié)ENO1的功能影響細(xì)胞CCL20 mRNA、ATP和乳酸產(chǎn)生及增殖和遷移能

14、力
　　1) qRT-PCR結(jié)果顯示FBXW7通過(guò)負(fù)性調(diào)控ENO1抑制細(xì)胞CCL20的表達(dá)。
　　2) ATP及乳酸含量檢測(cè)顯示FBXW7通過(guò)負(fù)性調(diào)控ENO1抑制細(xì)胞ATP和乳酸的產(chǎn)生。
　　3) MTT和劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示FBXW7通過(guò)負(fù)性調(diào)控ENO1抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和遷移。
　　研究結(jié)論和意義：
　　我們的研究結(jié)果表明FBXW7可以通過(guò)靶向降解ENO1，負(fù)性調(diào)控ENO1的功能從而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和