Fbxw7通過泛素化蛋白酶解YAP誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡和生長停滯.pdf

1、背景：
　　原發(fā)性肝癌（Primary liver cancer，P L C)是我國最常見的惡性腫瘤之一，病死率在各種癌癥病死率中居第2位，其中肝細(xì)胞癌（Hepatocellular carcinoma，H C C)占PLC的90％以上。H C C發(fā)病率逐年升高，隨著高危人群篩查、肝移植技術(shù)的成熟、影像學(xué)早期診斷以及經(jīng)動(dòng)脈化療栓塞（Transcatheter arterial chemoembolization，TACE)、射頻消

2、融（Radiofrequency ablation，R F A)和索拉菲尼（Sorafenib)等輔助治療的臨床應(yīng)用，HCC患者的預(yù)后較前已經(jīng)有了明顯的改善，但總體上還未取得令人滿意的療效。分子靶向藥物索拉菲尼的臨床應(yīng)用彌補(bǔ)了晚期HCC患者治療手段的空缺，因此，進(jìn)一步明確 HCC發(fā)生發(fā)展涉及的精確分子機(jī)制，探索HCC早期診斷分子標(biāo)志物、設(shè)計(jì)有效的腫瘤治療分子靶點(diǎn)以及患者預(yù)后指示標(biāo)志物，對(duì)提高我國肝癌的治療水平和改善腫瘤患者預(yù)后具有重要意

3、義。
　　泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解通路是基因和蛋白質(zhì)功能的主要調(diào)節(jié)者和終結(jié)者，控制著真核細(xì)胞內(nèi)絕大多數(shù)蛋白質(zhì)的降解，因此，對(duì)該通路的調(diào)控已成為疾病治療中的一種創(chuàng)新性方法。F框/WD_40域蛋白7(F-box and W D repeat domain-containing7，F(xiàn)bxw7)是 SCF(Skpl-Cullinl-F-box)類泛素連接酶E3復(fù)合體中特異性識(shí)別底物的關(guān)鍵因子，能夠革巴向泛素化降解Cyclin E，c-Myc，

4、c-Jun，Mcl-1(Myeloid cell leukemia-1)和Notch等癌蛋白，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并增加化療敏感性。研究表明Fbxw7在多種惡性腫瘤中表達(dá)缺失，其低表達(dá)與患者不良預(yù)后密切相關(guān)，是一種廣泛的抑癌基因。p53在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)，^53_/+^&^7_/+基因敲除小鼠和受輻射的Ffcw7_/+小鼠均自發(fā)產(chǎn)生包括H C C在內(nèi)的多種腫瘤，提示Fbxw7與 H C C的發(fā)生發(fā)展存在著某種聯(lián)系。Fb

5、xw7的多個(gè)祀蛋白如Cyclin E，c-Myc，c-Jun和Notch等在HCC中存在表達(dá)異常，且與HCC增殖、凋亡、耐藥及不良預(yù)后密切相關(guān)。
　　Hippo信號(hào)通路在哺乳動(dòng)物中是一個(gè)高度保守有效的細(xì)胞生長和凋亡調(diào)控因子，在許多人類腫瘤特別是H C C中存在該通路的異常，而該通路的核心效應(yīng)分子是Yes相關(guān)蛋白（Yes-associated protein，YAP)。在HCC和乳腺癌中YAP被鑒定為位于llq22擴(kuò)增子的一個(gè)促癌基

6、因，Y A P轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)肝臟體積明顯增大并最終產(chǎn)生腫瘤，臨床研究發(fā)現(xiàn)YAP是一個(gè)與HCC患者無病生存期和總生存期相關(guān)的獨(dú)立預(yù)測因素，提示Hippo-YAP信號(hào)通路在H C C發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著極其重要的作用。有研究使用液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用（Liquid chromatograph-mass spectrometer/ mass spectrometer,LC-MS/MS)技術(shù)分析有絲分裂相關(guān)蛋白磷酸化位點(diǎn)，YAP蛋白共鑒定出17條

7、磷酸肽和16個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中S131和 T141位點(diǎn)[(L)-V-pS-P-(P)-G-pT]包含F(xiàn)bxw7結(jié)合的保守 CDC4磷酸決定子（CDC4 phospho-degron，C P D)序列[(L)-X-pT/pS-P-(P)-X-pS/pT/E/D]，提示Y A P可能是F b x w7潛在的靶蛋白。
　　Fbxw7在H C C中是否表達(dá)異常？是否與H C C臨床病理特征相關(guān)？其表達(dá)變化是否影響H C C的增殖及凋亡？確

8、切的分子機(jī)制是否涉及Hippo-YAP信號(hào)通路？目前尚不清楚。
　　目的：
　　本實(shí)驗(yàn)旨在探討Fbxw7在H C C的表達(dá)及其對(duì)H C C細(xì)胞增殖和凋亡的影響，研究Fbxw7在H C C發(fā)生發(fā)展中的作用，并初步探討其可能的分子機(jī)制，為尋找H C C新的治療靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.應(yīng)用免疫組化染色、Western blot和 qRT-PCR檢測Fbxw7在H C C及對(duì)應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)，分析Fbxw7

9、與H C C臨床病理特征的相關(guān)性。
　　2.應(yīng)用qRT-PCR鑒定Fbxw7 mRNA在永生化人肝細(xì)胞系L02和 HCC細(xì)胞系HepG2、Hep3B、SMMC-7721、Bel-7402及Huh7的表達(dá)水平。
　　3.應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的Flag-Fbxw7和Fbxw7-shRNA分別轉(zhuǎn)染HepG2和Hep3B細(xì)胞，qRT-PCR和Western blot檢測Fbxw7表達(dá)變化，流式細(xì)胞術(shù)、Caspase3/7活性分析、Br

10、dU細(xì)胞增殖分析和MTT法檢測細(xì)胞增殖和凋亡變化。
　　4.應(yīng)用免疫組化染色檢測YAP在 HCC及對(duì)應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)，分析YAP與Fbxw7蛋白蛋白表達(dá)相關(guān)性。
　　5.應(yīng)用 Flag-Fbxw7和Fbxw7 shRNA分別轉(zhuǎn)染 HepG2和Hep3B細(xì)胞，qRT-PCR、Western blot和免疫熒光染色檢測YAP表達(dá)變化。
　　6. HEK293細(xì)胞共轉(zhuǎn)染Flag-Fbxw7和 HA-YAP，免疫共沉淀檢測F

11、bxw7與 YAP之間的相互作用；Flag-Fbxw7轉(zhuǎn)染過表達(dá)H A-Y A P的H e p G2細(xì)胞，免疫共沉淀檢測YAP蛋白泛素化水平變化；CHX追蹤分析檢測Fbxw7過表達(dá)對(duì)HepG2細(xì)胞中YAP蛋白半衰期的影響。
　　7. HA-YAP轉(zhuǎn)染 Fbxw7過表達(dá)的Hep3B細(xì)胞，Western blot檢測 Fbxw7和YAP蛋白表達(dá)變化，流式細(xì)胞術(shù)、Caspase3/7活性分析、B r d U細(xì)胞增殖分析和M T T法檢測

12、細(xì)胞增殖和凋亡變化。
　　8.分別應(yīng)用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染E V、Flag-Fbxw7及 Flag-Fbxw7+HA-YAP的H e p3 B細(xì)胞構(gòu)建裸鼠皮下種植瘤模型，繪制腫瘤生長曲線；免疫組化和TUNEL技術(shù)檢測各組瘤體標(biāo)本中YAP、Ki-67和凋亡變化。
　　結(jié)果：
　　1. Fbxw7在 H C C組織中的表達(dá)水平顯著低于對(duì)應(yīng)癌旁組織（P<0.01); Fbxw7蛋白在較大腫瘤體積（25cm)、血管侵犯、高 T N M分期

13、和高病理分級(jí)的H C C組織中表達(dá)顯著降低（P<0.05)。
　　2.所有細(xì)胞系中均能檢測到Fbxw7 mRNA表達(dá)，其在L02細(xì)胞中表達(dá)最高，SMMC-7721細(xì)胞中表達(dá)最低。
　　3. Fbxw7過表達(dá)誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡和生長停滯（P<0.01);敲低Fbxw7導(dǎo)致Hep3B細(xì)胞凋亡抵抗和生長加速（P<0.01)。
　　4. Y A P在H C C組織中的表達(dá)水平顯著高于對(duì)應(yīng)癌旁組織(P<0.01);Fbxw7

14、與YAP蛋白表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.572，i^O.OCB)。
　　5.在HepG2細(xì)胞中過表達(dá)Fbxw7不影響YAP mRNA表達(dá)，但下調(diào)YAP蛋白水平(^<0.01)；在 Hep3B細(xì)胞中敲低Fbxw7不影響YAP mRNA表達(dá)，但導(dǎo)致YAP蛋白蓄積（P O.O l)。
　　6. Fbxw7與YAP蛋白存在相互作用，過表達(dá)Fbxw7導(dǎo)致HepG2細(xì)胞中YAP蛋白泛素化水平升高且半衰期縮短。
　　7.恢復(fù)Y A

15、P蛋白表達(dá)能夠部分消除Fbxw7誘導(dǎo)的Hep3B細(xì)胞體外凋亡和生長阻滯（尸<0.01)。
　　8. Fbxw7顯著抑制Hep3B細(xì)胞體內(nèi)生長，恢復(fù)Y A P蛋白表達(dá)能部分逆轉(zhuǎn)Fbxw7對(duì)Hep3B細(xì)胞的體內(nèi)凋亡誘導(dǎo)和生長抑制作用（P<0.01)。
　　結(jié)論：
　　1. Fbxw7低表達(dá)與H C C惡性臨床病理特征相關(guān)，且Fbxw7與癌蛋白Y A P表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，F(xiàn)bxw7可能作為潛在的H C C患者預(yù)后指示分子。<