白念珠菌Sac1蛋白的鑒定及其功能的研究.pdf

1、白念珠菌是臨床上最為重要的條件性致病真菌之一。由于免疫缺陷人群的不斷增加，白念珠菌引起的感染備受關(guān)注。在與宿主相互作用的過程中，白念珠菌進化出極為精細的形態(tài)發(fā)生及壓力應(yīng)答系統(tǒng)，能夠有效定殖并抵御宿主免疫系統(tǒng)攻擊。磷脂酰肌醇衍生物是真核細胞極為重要的一類小分子物質(zhì)，與細胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、生長代謝調(diào)節(jié)緊密相關(guān)。在釀酒酵母及許多哺乳動物細胞中，磷脂酰肌醇磷酸酶Sac1及其同源蛋白介導(dǎo)了磷脂酰肌醇一磷酸或磷脂酰肌醇二磷酸向磷脂酰肌醇的轉(zhuǎn)化，在肌動蛋

2、白組裝、細胞極性確立、細胞壁功能維持、胞吞與胞吐等過程中扮演重要角色。然而，白念珠菌的Sac1蛋白及其功能至今尚未明確。本研究即對白念珠菌的Sac1蛋白進行分子鑒定及功能分析。主要結(jié)果如下：
　?。?）通過BLASTP分析，從白念珠菌基因組數(shù)據(jù)庫中鑒定出一種與釀酒酵母ScSac1同源的蛋白，命名為Sac1。序列比對分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白屬于SAC家族成員，具有保守的 CX5R(T/S)基序及 SAC結(jié)構(gòu)域。通過構(gòu)建白念珠菌 SAC1基因

3、在釀酒酵母中的回補菌株，發(fā)現(xiàn)該基因能夠回補釀酒酵母ScSAC1缺失造成的肌醇營養(yǎng)缺陷，提示白念珠菌Sac1蛋白參與了磷脂酰肌醇代謝。通過GFP定位技術(shù)，發(fā)現(xiàn)Sac1蛋白主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，提示該蛋白與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能緊密相關(guān)。
　?。?）采用兩步PCR介導(dǎo)的同源重組法，構(gòu)建白念珠菌SAC1基因的缺失菌株，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建回補菌株。采用固體點板實驗，發(fā)現(xiàn)SAC1基因的缺失造成白念珠菌對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力及細胞壁壓力藥物高度敏感；酸性磷酸酶分析實驗表

4、明， SAC1基因的缺失導(dǎo)致白念珠菌的糖基化能力發(fā)生缺陷；幾丁質(zhì)染色及透射電鏡觀察結(jié)果顯示，該基因缺失導(dǎo)致細胞壁幾丁質(zhì)分布與含量發(fā)生改變，以及細胞壁超顯微結(jié)構(gòu)異常；采用GFP報告系統(tǒng)及實時定量PCR技術(shù)，發(fā)現(xiàn)該基因的缺失導(dǎo)致非折疊蛋白應(yīng)答（UPR）基因及細胞壁完整性（CWI）基因表達的上調(diào)。上述結(jié)果表明Sac1蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及細胞壁完整性維持方面發(fā)揮重要作用。
　?。?）SAC1基因缺失導(dǎo)致白念珠菌菌絲發(fā)育能力降低，細胞僅能形成彎曲

5、的菌絲，提示sac1Δ/Δ缺失株菌絲的極性生長能力受阻。肌動蛋白染色及Hwp1定位分析表明，SAC1基因缺失導(dǎo)致肌動蛋白斑在菌絲頂端的定位發(fā)生紊亂，以及菌絲特異性蛋白的極性轉(zhuǎn)運過程存在缺陷，表明Sac1通過維持肌動蛋白骨架的頂端定位，調(diào)控菌絲特異性蛋白的極性轉(zhuǎn)運過程。
　　（4）SAC1基因缺失導(dǎo)致白念珠菌侵染宿主上皮細胞及耐受巨噬細胞攻擊的能力顯著下降，并且喪失了系統(tǒng)性感染小鼠的能力，表明Sac1與白念珠菌的毒力緊密相關(guān)，是一種