白念珠菌Sac1蛋白的鑒定及其功能的研究.pdf

1、白念珠菌是臨床上最為重要的條件性致病真菌之一。由于免疫缺陷人群的不斷增加，白念珠菌引起的感染備受關(guān)注。在與宿主相互作用的過(guò)程中，白念珠菌進(jìn)化出極為精細(xì)的形態(tài)發(fā)生及壓力應(yīng)答系統(tǒng)，能夠有效定殖并抵御宿主免疫系統(tǒng)攻擊。磷脂酰肌醇衍生物是真核細(xì)胞極為重要的一類小分子物質(zhì)，與細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、生長(zhǎng)代謝調(diào)節(jié)緊密相關(guān)。在釀酒酵母及許多哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，磷脂酰肌醇磷酸酶Sac1及其同源蛋白介導(dǎo)了磷脂酰肌醇一磷酸或磷脂酰肌醇二磷酸向磷脂酰肌醇的轉(zhuǎn)化，在肌動(dòng)蛋

2、白組裝、細(xì)胞極性確立、細(xì)胞壁功能維持、胞吞與胞吐等過(guò)程中扮演重要角色。然而，白念珠菌的Sac1蛋白及其功能至今尚未明確。本研究即對(duì)白念珠菌的Sac1蛋白進(jìn)行分子鑒定及功能分析。主要結(jié)果如下：
　　（1）通過(guò)BLASTP分析，從白念珠菌基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定出一種與釀酒酵母ScSac1同源的蛋白，命名為Sac1。序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白屬于SAC家族成員，具有保守的 CX5R(T/S)基序及 SAC結(jié)構(gòu)域。通過(guò)構(gòu)建白念珠菌 SAC1基因

3、在釀酒酵母中的回補(bǔ)菌株，發(fā)現(xiàn)該基因能夠回補(bǔ)釀酒酵母ScSAC1缺失造成的肌醇營(yíng)養(yǎng)缺陷，提示白念珠菌Sac1蛋白參與了磷脂酰肌醇代謝。通過(guò)GFP定位技術(shù)，發(fā)現(xiàn)Sac1蛋白主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，提示該蛋白與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能緊密相關(guān)。
　?。?）采用兩步PCR介導(dǎo)的同源重組法，構(gòu)建白念珠菌SAC1基因的缺失菌株，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建回補(bǔ)菌株。采用固體點(diǎn)板實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)SAC1基因的缺失造成白念珠菌對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力及細(xì)胞壁壓力藥物高度敏感；酸性磷酸酶分析實(shí)驗(yàn)表

4、明， SAC1基因的缺失導(dǎo)致白念珠菌的糖基化能力發(fā)生缺陷；幾丁質(zhì)染色及透射電鏡觀察結(jié)果顯示，該基因缺失導(dǎo)致細(xì)胞壁幾丁質(zhì)分布與含量發(fā)生改變，以及細(xì)胞壁超顯微結(jié)構(gòu)異常；采用GFP報(bào)告系統(tǒng)及實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，發(fā)現(xiàn)該基因的缺失導(dǎo)致非折疊蛋白應(yīng)答（UPR）基因及細(xì)胞壁完整性（CWI）基因表達(dá)的上調(diào)。上述結(jié)果表明Sac1蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及細(xì)胞壁完整性維持方面發(fā)揮重要作用。
　　（3）SAC1基因缺失導(dǎo)致白念珠菌菌絲發(fā)育能力降低，細(xì)胞僅能形成彎曲

5、的菌絲，提示sac1Δ/Δ缺失株菌絲的極性生長(zhǎng)能力受阻。肌動(dòng)蛋白染色及Hwp1定位分析表明，SAC1基因缺失導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白斑在菌絲頂端的定位發(fā)生紊亂，以及菌絲特異性蛋白的極性轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程存在缺陷，表明Sac1通過(guò)維持肌動(dòng)蛋白骨架的頂端定位，調(diào)控菌絲特異性蛋白的極性轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。
　?。?）SAC1基因缺失導(dǎo)致白念珠菌侵染宿主上皮細(xì)胞及耐受巨噬細(xì)胞攻擊的能力顯著下降，并且喪失了系統(tǒng)性感染小鼠的能力，表明Sac1與白念珠菌的毒力緊密相關(guān)，是一種