基于質(zhì)譜的糖蛋白質(zhì)組學(xué)-糖組學(xué)的新技術(shù)與新方法研究.pdf

1、本論文工作的主要貢獻(xiàn)有以下點(diǎn):
　　(1)將傳統(tǒng)的糖蛋白質(zhì)組學(xué)和糖組學(xué)研究手段第一次應(yīng)用于亞洲最多的三種毒蛇毒素大規(guī)模N-糖基化研究中。通過優(yōu)化和組合N-糖蛋白和N-糖鏈鑒定技術(shù)，對(duì)三種蛇毒中的N-糖蛋白和N-糖鏈進(jìn)行了較為全面的分析和鑒定，建立了目前蛇毒中大規(guī)模的糖基化鑒定數(shù)據(jù)集。
　　(2)對(duì)兩種常用的傳統(tǒng)的唾液酸化N-糖肽富集方法進(jìn)行了系統(tǒng)的比較，在此基礎(chǔ)上成功發(fā)展了一種新的唾液酸化N-糖肽富集的方法:肽段IPG-IE

2、F輔助TiO2富集法[peptide immobilized pH gradient isoelectric focusing(IPG-IEF) assistant TiO2 chromatography，PIAT]，并將該新方法有效應(yīng)用于大鼠肝臟組織中大規(guī)模唾液酸化N-糖蛋白的鑒定，建立了目前大鼠肝臟組織中唾液酸化糖蛋白最大的數(shù)據(jù)集，解決了當(dāng)今唾液酸化蛋白富集鑒定困難的問題，為唾液酸化糖基化修飾研究提供了新的有效富集手段。
　　

3、(3)發(fā)展了硼氫化鈉輔助的酶促N-糖鏈雙同位素標(biāo)記定量技術(shù)，該標(biāo)記定量技術(shù)的創(chuàng)新點(diǎn)在于，不僅大大增加了糖鏈16O/18O標(biāo)記的穩(wěn)定性，同時(shí)使得糖鏈質(zhì)量差異增加到3 Da，大大降低了同位素重疊效應(yīng)對(duì)于定量準(zhǔn)確性的影響，彌補(bǔ)了PNGase F用于糖鏈定量的技術(shù)空白。并將該方法應(yīng)用于肝癌相關(guān)血清N-糖鏈定量的研究，發(fā)現(xiàn)了一些在肝癌血清中顯著變化的糖鏈，為進(jìn)一步尋找潛在的診斷標(biāo)志物以及糖鏈的功能研究奠定了基礎(chǔ)。
　　(4)利用BEMAD富

4、集法的優(yōu)勢(shì)，聯(lián)合質(zhì)譜檢測(cè)和免疫學(xué)方法證明并驗(yàn)證在大鼠肝臟線粒體中存在O-GlcNAc修飾的蛋白;通過對(duì)鑒定到的線粒體中O-GlcNAc修飾的蛋白進(jìn)行磷酸化修飾檢索分析，發(fā)現(xiàn)線粒體中O-GlcNAc修飾和磷酸化修飾之間存在潛在的“cross talk”。
　　本論文前言部分對(duì)蛋白質(zhì)糖基化，及其研究技術(shù)、內(nèi)容、現(xiàn)狀和目前面臨的挑戰(zhàn)進(jìn)行了概述，闡述了本論文選題的目的和意義;然后分別從以下幾方面進(jìn)行闡述:
　　基于糖蛋白質(zhì)組學(xué)與糖組

5、學(xué)研究策略的大規(guī)模蛇毒糖基化后修飾的研究
　　蛇的毒液中含有多種具有生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)及其類似物，這些活性物質(zhì)有著重要的醫(yī)學(xué)和藥學(xué)價(jià)值。這些活性蛋白質(zhì)常常發(fā)生N-糖基化修飾。N-糖基化修飾對(duì)毒液中活性蛋白質(zhì)的生物學(xué)和毒理功能有著重要的影響。目前，系統(tǒng)的研究蛇毒毒液中蛋白質(zhì)的糖組和糖蛋白質(zhì)組的研究甚少。
　　在該部分，我們組合糖組學(xué)和糖蛋白質(zhì)組學(xué)的研究策略對(duì)三種亞洲常見蛇（日本蝮蛇，眼鏡蛇舟山亞種，蝰蛇泰國亞種）的毒液的N-糖

6、鏈和N-糖基化蛋白質(zhì)進(jìn)行了分析，在三種蛇毒中，分別鑒定到9個(gè)，8個(gè)，18個(gè)N-糖基化蛋白質(zhì)，115，100，95條N-糖鏈。其中大部分N-糖蛋白和N-糖鏈為首次鑒定到，為蛇毒蛋白數(shù)據(jù)庫提供了大量新的糖基化修飾信息。此外，通過分析我們發(fā)現(xiàn)三種蛇毒糖基化鑒定結(jié)果交蓋非常的少，這暗示著蛇毒中糖基化修飾存在很大的差異。
　　肽段IPG-IEF輔助TiO2富集唾液酸化N-糖肽新方法及其在大規(guī)模唾液酸化N-糖蛋白鑒定中的應(yīng)用
　　唾液酸

7、化糖基化具有重要的生理和病理意義，例如，細(xì)胞表面唾液酸化水平的改變與腫瘤的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后顯著相關(guān)。近年來，唾液酸化糖蛋白/糖肽的分離富集技術(shù)備受研究者的重視。目前已發(fā)展了多種唾液酸化糖蛋白/糖肽富集的方法。然而由于糖基化修飾的復(fù)雜性，以及唾液酸化糖蛋白的特殊性質(zhì)，目前這些策略對(duì)于唾液酸化糖蛋白的富集和鑒定效率有限，因此有必要發(fā)展更加有效的唾液酸化糖蛋白/糖肽富集方法。
　　在該部分，我們以大鼠肝臟蛋白質(zhì)為研究對(duì)象，不僅首次比較了

8、傳統(tǒng)的唾液酸肽段富集方法，凝集素法(MAL/SNA)和二氧化鈦方法，并且基于唾液酸的負(fù)電性，創(chuàng)新性地發(fā)展了一種新的唾液酸化糖肽富集策略:肽段固相pH梯度等電聚焦-二氧化鈦色譜富集法[peptide immobilized pH gradient isoelectricfocusing(IPG-IEF) assistant TiO2 chromatography，PIAT]，即將提取的大鼠肝臟蛋白質(zhì)，經(jīng)胰蛋白酶消化成肽段后，首先用固相pH

9、梯度等電聚焦方法將肽段分離成24個(gè)組分，由于唾液酸的負(fù)電性，唾液酸化肽段將相對(duì)濃縮在低pH組分中，經(jīng)過此步的預(yù)分離之后，抽提組分中的肽段，并用二氧化鈦色譜法進(jìn)一步富集唾液酸糖肽，之后采用C18反相液相色譜在線電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜(LC-ESI-MS/MS)進(jìn)行在線分離分析鑒定。采用此戰(zhàn)略，我們對(duì)大鼠肝臟蛋白質(zhì)的唾液酸化糖蛋白/糖肽進(jìn)行了大規(guī)模的研究鑒定，共鑒定到322個(gè)唾液酸化糖蛋白，包括582個(gè)唾液酸化糖肽和614個(gè)N-糖基化位點(diǎn)。目前

10、，我們鑒定到的大鼠肝臟蛋白質(zhì)唾液酸化糖蛋白/糖肽是規(guī)模最大的。和傳統(tǒng)的凝集素法及TiO2法相比，PIAT法鑒定到的唾液酸化糖蛋白/糖肽數(shù)量更多，蛋白和肽段的等電點(diǎn)、分子量分布，亞細(xì)胞器定位范圍更廣。這種新的富集方法具有重現(xiàn)性高、特異性好、富集效率更高，普適性更好等特點(diǎn)，作為唾液酸化糖肽富集的有力工具，具有良好的應(yīng)用前景。
　　N-糖鏈雙同位素標(biāo)記定量技術(shù)及其在定量糖組學(xué)中的應(yīng)用
　　糖基化定量研究，同糖鏈解析、糖蛋白鑒定一樣

11、，是蛋白質(zhì)糖基化修飾研究領(lǐng)域的一個(gè)重要部分。隨著糖生物學(xué)的深入發(fā)展及糖鏈鑒定技術(shù)的快速進(jìn)步，定量糖組學(xué)逐漸成為糖基化修飾領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。定量糖組學(xué)旨在研究不同生理和病理過程中糖鏈的整體變化情況，這對(duì)于尋找疾病潛在標(biāo)志物有著重要的意義。傳統(tǒng)的糖組學(xué)定量方法多采用凝集素芯片等基于某一類糖型的定量。隨著生物質(zhì)譜技術(shù)的不斷發(fā)展，基于質(zhì)譜的糖組學(xué)定量技術(shù)也得到了相應(yīng)的發(fā)展。同位素標(biāo)記定量是糖鏈定量技術(shù)中一種重要的方法。已發(fā)展了多種同位素標(biāo)記糖鏈定

12、量技術(shù)，包括還原末端標(biāo)記技術(shù)、全甲基化標(biāo)記技術(shù)以及代謝標(biāo)記技術(shù)。
　　本部分研究首次嘗試使用硼氫化鈉處理標(biāo)記后的N-糖鏈，通過條件優(yōu)化使得所有N-糖鏈末端被還原。被還原的18O標(biāo)記的糖鏈變得非常穩(wěn)定，使18O標(biāo)記的糖鏈可以長(zhǎng)期保存于普通水溶液中，而不會(huì)與普通水中的16O原子發(fā)生交換。此外，我們還首次使用NaBH4/NaBD4分別處理16O/18O標(biāo)記的N-糖鏈，成功實(shí)現(xiàn)了16O/18O標(biāo)記后N-糖鏈末端H/D的標(biāo)記，從而創(chuàng)造性地發(fā)

13、展了糖鏈的雙同位素標(biāo)記定量方法，即16O+H/18O+D標(biāo)記，此標(biāo)記技術(shù)使得糖鏈的質(zhì)量差異擴(kuò)大到3Da，大大降低了同位素峰重疊對(duì)糖鏈相對(duì)定量準(zhǔn)確性的干擾，同時(shí)使得糖鏈18O標(biāo)記更加的穩(wěn)定，優(yōu)化了糖鏈18O標(biāo)記定量技術(shù)。我們還將該雙同位素標(biāo)記定量技術(shù)應(yīng)用于大鼠血清N-糖鏈定量，成功實(shí)現(xiàn)了該方法在復(fù)雜生物樣本定量糖組學(xué)中的應(yīng)用。此外，我們還利用該技術(shù)對(duì)正常人血清與肝癌病人血清進(jìn)行了定量糖組學(xué)研究，證明了該技術(shù)的有效性和潛在應(yīng)用價(jià)值。該部分的

14、研究意義和創(chuàng)新如下:(1)首次在N-糖鏈標(biāo)記中引入NaBH4/NaBD4，引入的NaBH4/NaBD4將PNGase F酶促標(biāo)記后的糖鏈末端還原為糖醇，使得糖鏈的16O/18O標(biāo)記更加穩(wěn)定;(2)創(chuàng)造性發(fā)展了NaBH4/NaBD4輔助的PNGase F酶促糖鏈標(biāo)記技術(shù)，該技術(shù)使得糖鏈末端被標(biāo)記上16O+H/18O+D，雙同位素標(biāo)記的糖鏈質(zhì)量差異為3 Da，避免了同位素峰重疊效應(yīng)對(duì)于定量準(zhǔn)確性的影響;(3)該N-糖鏈定量技術(shù)標(biāo)記效率高，定

15、量準(zhǔn)確性和重復(fù)性好，且可應(yīng)用于復(fù)雜生物樣本定量糖組學(xué)的分析，為定量糖組學(xué)研究提供了有力的方法;(4)將該N-糖鏈定量技術(shù)應(yīng)用于肝癌相關(guān)的血清N-糖鏈定量研究，發(fā)現(xiàn)平分型和含有核心巖藻糖的N-糖鏈在肝癌病人血清中變化明顯，提示肝癌的發(fā)生發(fā)展可能同這些N-糖鏈結(jié)構(gòu)的改變有關(guān)，為進(jìn)一步尋找潛在的診斷標(biāo)志物以及糖鏈的功能研究奠定了基礎(chǔ)。
　　多種質(zhì)譜檢測(cè)聯(lián)合免疫學(xué)方法用于大鼠肝臟線粒體中O-GlcNAc修飾蛋白的研究
　　O-Glc

16、NAc糖基化修飾是指單個(gè)N-乙酰葡萄糖胺(N-acetylglucosamine，GlcNAc)以O(shè)-糖苷鍵與蛋白質(zhì)的絲氨酸(Serine，Ser)或蘇氨酸(Threonine，Thr)的羥基相連接，是一種重要的胞內(nèi)修飾調(diào)控方式，參與細(xì)胞的多種應(yīng)激響應(yīng)以及細(xì)胞進(jìn)程，如信號(hào)傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄、翻譯、蛋白質(zhì)降解以及細(xì)胞周期調(diào)控等。O-GlcNAc糖基化異常與一些疾病如糖尿病、帕金森病、阿爾茲海默病等有緊密聯(lián)系。據(jù)報(bào)道，O-GlcNAc廣泛存在于細(xì)胞

17、核與細(xì)胞質(zhì)中，就其在線粒體中的發(fā)生，研究甚少，目前為止，只有屈指可數(shù)的幾個(gè)報(bào)道，而且也未得到驗(yàn)證。
　　基于O-GlcNAc糖基化修飾的重要性和其與磷酸化修飾的相似性，我們從大鼠肝臟中提取線粒體蛋白質(zhì)來研究線粒體中O-GlcNAc糖基化修飾。我們聯(lián)合了質(zhì)譜以及免疫學(xué)等多種檢測(cè)方法，在線粒體中成功鑒定到11個(gè)O-GlcNAc糖基化蛋白，包括14個(gè)O-GlcNAc糖基化修飾位點(diǎn)，并對(duì)這些結(jié)果用ETD-MS/MS和免疫學(xué)的方法進(jìn)行了嚴(yán)謹(jǐn)