乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因篩選及功能研究.pdf

1、目的：篩選新的乳腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因并進(jìn)行功能研究，為乳腺癌診斷提供分子標(biāo)志，為乳腺癌治療提供靶點(diǎn)，為闡明乳腺癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移機(jī)制提供線索。
　　 方法：利用mRNA差異顯示技術(shù)篩選乳腺原發(fā)癌與配對(duì)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織的差異表達(dá)基因片段；利用同位素標(biāo)記的反向斑點(diǎn)雜交和熒光標(biāo)記的基因芯片雜交方法驗(yàn)證候選差異基因。采用實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)方法(qRT-PCR)檢測(cè)乳腺癌原發(fā)癌組織及癌旁正常組織中kinesin-like4(KNSL4)基

2、因mRNA表達(dá)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析與乳腺癌發(fā)生、臨床病理因素和患者預(yù)后的關(guān)系；采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)乳腺癌組織中KNSL4基因編碼的驅(qū)動(dòng)蛋白樣DNA結(jié)合蛋白Kid的表達(dá)，分析Kid的組織細(xì)胞定位及與細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)系?？寺NSL4 siRNA真核表達(dá)質(zhì)粒載體pSilencerTM3.1-KNSL4 siRNA，轉(zhuǎn)染高表達(dá)Kid的人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-435S，并建立穩(wěn)定沉默KNSL4表達(dá)的亞克隆細(xì)胞，以觀察KNSL4及其編碼蛋白Ki

3、d對(duì)細(xì)胞體內(nèi)外生物學(xué)行為的影響。采用染色質(zhì)免疫沉淀聯(lián)合啟動(dòng)子芯片(ChIP-on-chip)方法篩選Kid下游調(diào)控基因，ChIP-qPCR方法驗(yàn)證篩選基因與Kid的結(jié)合，qRT-PCR方法分析下調(diào)乳腺癌細(xì)胞Kid表達(dá)對(duì)候選基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用。
　　 結(jié)果：篩選得到4個(gè)未知的基因序列(Expressed Sequence Tag，EST)登錄在GenBank，序列號(hào)為BG518428、BG518429、BM005520、BM005

4、521；驗(yàn)證證實(shí)KNSL4基因在乳腺轉(zhuǎn)移癌中表達(dá)下調(diào)。KNSL4 mRNA在癌組織中表達(dá)，而在正常組織中不表達(dá)(P=0.000)；KNSL4 mRNA低水平患者5年無(wú)病生存期低于高水平患者(P=0.016)，KNSL4 mRNA水平是臨床Ⅰ～Ⅱ期和Her2陽(yáng)性乳腺癌患者預(yù)后預(yù)測(cè)分子標(biāo)志物(P=0.023，P=0.041)。Kid蛋白在增殖的腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，而在侵襲和遷移的細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)。KNSL4基因轉(zhuǎn)錄沉默的亞克隆細(xì)胞增殖能力降低，

5、細(xì)胞周期G2期比率增加，細(xì)胞有絲分裂阻滯，而細(xì)胞的克隆形成率沒(méi)有影響，體內(nèi)和體外的侵襲和遷移能力也沒(méi)有改變。CDC25C和ATF7IP是Kid作為轉(zhuǎn)錄因子的下游調(diào)節(jié)基因，且Kid對(duì)二者起負(fù)調(diào)控作用。
　　 結(jié)論：KNSL4基因及其編碼蛋白Kid是乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移狀態(tài)的指示者，而非轉(zhuǎn)移生物學(xué)過(guò)程的調(diào)控者。Kid在細(xì)胞有絲分裂中起關(guān)鍵作用，與CDC25C形成的負(fù)反饋調(diào)節(jié)環(huán)異?？梢允辜?xì)胞有絲分裂異常，進(jìn)而使細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化和惡性增殖。KNS