戊四氮致癇后大鼠海馬中Caspase3和Hsp70的動態(tài)表達變化.pdf

1、目的:癲癇是以腦神經元過度異常放電導致反復發(fā)作性和短暫性的中樞神經系統(tǒng)功能失常為特征的一種腦功能失調綜合征,其發(fā)病機制仍不清楚。
　　 癲癇可致腦損傷,細胞凋亡或稱程序性細胞死亡啟動一系列復雜的蛋白酶級聯反應,是癲癇致腦損傷的一條重要途徑。長時間癲癇反復發(fā)作后可出現腦內選擇性的神經元凋亡壞死和海馬硬化,一旦出現了海馬硬化,則腦組織損傷及記憶功能障礙將不可逆。通過腹腔注射戊四氮(pentylenetrazol,PTZ)建立癲癇持續(xù)

2、狀態(tài)大鼠模型來觀察大鼠海馬組織的形態(tài)學改變,如采用Nissl染色法檢測神經細胞丟失壞死情況;Timm染色法觀察海馬組織苔蘚纖維出芽情況;電鏡觀察海馬CA3區(qū)的超微結構;同時運用免疫組化法計算陽性細胞的平均光密度值;Western blot方法分別檢測海馬組織中caspase3和hsp70的表達情況。初步探討了癲癇發(fā)作后caspase3介導的凋亡相關途徑和Hsp70的動態(tài)表達情況,將有助于從分子水平上更有效的尋求癲癇的治療靶點,及時進行干

3、預并控制凋亡的發(fā)生,為減輕癲癇致腦損傷提供新方法。
　　 方法:選取清潔級(SPF級)雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠70只,實驗起始體重(180±20)g,12h光亮/黑暗條件、22℃-25℃環(huán)境溫度,分籠喂養(yǎng)。實驗動物隨機分為癲癇持續(xù)狀態(tài)組(status epilepticus,SE組)和對照組(normal control group,NC組)兩個大組,SE組又分為癲癇發(fā)作后3h組、6h組、12h組、24h組,

4、5組各14只。SE各組大鼠應用生理鹽水溶解的1％PTZ溶液,首先按40 mg/kg腹腔注射,10 min后再給20 mg/kg,根據實驗動物的發(fā)作情況再適量追加10 mg/kg,直至出現Ⅳ級或Ⅴ級發(fā)作為止。Racine將點燃分為六級評價標準,至今仍在實驗中廣泛應用。0級,無任何反應:Ⅰ級,濕狗樣抖動,面部抽搐及咀嚼;Ⅱ級,頸部肌肉痙攣,表現為點頭和/或甩尾;Ⅲ級,一側前肢痙攣;Ⅳ級,雙側前肢痙攣伴站立;Ⅴ級,全身陣攣、失去平衡甚至跌倒。

5、完全點燃的標準是達到Ⅳ級或Ⅴ級發(fā)作且持續(xù)30min以上。對照組注射同等容量的生理鹽水。觀察大鼠行為學改變,后將各組大鼠隨機選取3只行Nissl染色和Timm染色法分別檢測海馬組織神經細胞丟失壞死情況和苔蘚纖維出芽情況,3只用于電鏡觀察海馬CA3區(qū)的超微結構,5只行免疫組化法計算陽性細胞的平均光密度值,3只用于Western blot法分別進行檢測海馬組織中caspase3和hsp70的表達情況。實驗過程中因持續(xù)強直發(fā)作而抽搐死亡的大鼠應

6、及時進行補充(已補充28只)。
　　 結果:1動物模型制備SE組有效應用的大鼠70只,11只應用40mg/kg、14只50mg/kg、15只60mg/kg、18只70mg/kg、8只80mg/kg、4只90mg/kg PTZ即開始出現驚厥,主要表現為節(jié)律性點頭、肌陣攣。隨著PTZ每10min注射一次,很快出現四肢抽搐,進入全面性強直發(fā)作致失去姿勢控制,前、后肢強烈收縮,并伴有呼吸抑制,口周發(fā)紫,持續(xù)時間長短不等。強直階段過后便出

7、現全面性強直一陣攣發(fā)作。NC組動物均無行為學改變。
　　 2大鼠海馬組織學改變
　　 2.1 Nissl染色觀察 SE組可見神經元皺縮體積縮小,胞核深染,有核分裂及核溶解,具有凋亡的特征,多數胞漿呈空泡狀,海馬CA1區(qū)細胞排列散亂,細胞密度小,尼氏體減少,部分神經元丟失,24h組最明顯,3h腦損傷最輕;對照組海馬神經元形態(tài)結構完整,胞核淡染、胞漿染色清晰,CA1區(qū)細胞幾乎呈均勻一致的紫藍色,細胞密度大,尼氏體著藍色,形態(tài)

8、接近正常。
　　 2.2 Timm染色法觀察 SE各亞組和對照組的CA3區(qū)苔蘚纖維出芽評分僅0～1分。
　　 2.3海馬CA3區(qū)超微結構觀察 SE組海馬CA3區(qū)可見神經元核膜邊界不清、可有內陷,染色質有邊集,線粒體數量減少或有腫脹,24h組最明顯,3h組較輕:對照組神經元核膜清晰,線粒體完整,細胞器基本完好。
　　 3腦組織中caspase3和hsp70表達情況 SE后3h caspase3和hsp70在海馬神經

9、細胞胞漿中著色開始增多,陽性細胞率(P＜0.01與對照組比較),并隨時間延長其陽性細胞率相應性升高,24h明顯增高(P＜0.01)。對照組可見caspase3和hsp70在海馬胞漿中呈現散在著色。
　　 4大鼠海馬中caspase3和hsp70的蛋白表達 SE后3h caspase3和hsp70表達開始增高(P＜0.05與對照組比較),24h明顯增高(P＜0.05)。對照組僅有少量的caspase3和hsp70表達。