體外建立血腦屏障細胞模型及其屏障功能的建立.pdf

1、目的:建立簡便、易行的能夠模擬在體血腦屏障的體外細胞模型.鑒定模型的屏障功能,為今后體外研究相關(guān)疾病提供一個工具.方法:①以SD大鼠為實驗材料,采用兩步濾過法獲得微血管段,膠原酶消化,低分子右旋糖苷密度離心獲得腦微血管內(nèi)皮細胞,接種4小時換液使獲得的細胞純化.倒置顯微鏡下觀察細胞的形態(tài),細胞Ⅷ因子相關(guān)抗原(ⅧF-Ag)免疫組化法鑒定細胞及其純度,通過堿性磷酸酶（ATP）的表達來分析內(nèi)皮細胞被微動脈和微靜脈污染的程度，通過測定內(nèi)皮細胞分泌

2、ET-1量，鑒定培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞活力②采用振蕩法分離純化1型星形膠質(zhì)細胞，GFAP抗體免疫組化法鑒定細胞及純度.③將傳至第2代的大鼠膠質(zhì)細胞接種于涂有鼠膠原的Transwell多聚酯膜底側(cè)，培養(yǎng)4小時后將Transwell倒轉(zhuǎn)放入正常位置，加培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)7天，待細胞貼壁牢固.將傳至第2代的腦微血管內(nèi)皮細胞接種于Transwell內(nèi)側(cè)，用與培養(yǎng)膠質(zhì)細胞相同的培養(yǎng)液，細胞共同培養(yǎng)一周.HE染色觀察細胞在多聚酯膜上的生長情況.檢測共培養(yǎng)以后血

3、腦屏障特異性酶γ-GT含量;測量內(nèi)皮細胞吞飲FITC-右旋糖苷（FITC-Dextran、分子量4kDa）量;測定經(jīng)BMEC細胞間隙進入BBB的熒光素鈉（FLU，分子量376Da）的通透性，通透性用通透系數(shù)表示，記錄不同時間點（0.5h、1h、2h、4h）<'125>I-BSA(分子量66kDa）的通透量④研究人臍靜脈內(nèi)皮細胞與1型星形膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)模型的熒光素鈉、<'125>I-BSA通透量.結(jié)論：①我們實驗采用的兩步濾過獲得腦微血管

4、段，膠原酶消化，低分子量右旋糖苷密度離心可分離和培養(yǎng)大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞.這一方法較其他方法程序簡單，獲得細胞純度高，適合用于體外BBB模型的建立.②通過腦微血管內(nèi)皮細胞與1型星形膠質(zhì)細胞共培養(yǎng)能夠形成與在體血腦屏障類似的結(jié)構(gòu)，并具有在體屏障的限制物質(zhì)通透、酶屏障的功能.但在細胞吞飲方面與在體BBB有差異.這方面的研究結(jié)果在國內(nèi)還未見有報道.這一模型適合用于BBB物質(zhì)轉(zhuǎn)運和BBB細胞功能特性方面的研究.③人臍血管內(nèi)皮細胞與1型星形膠質(zhì)細