血腫瘤屏障體外模型的建立及天然冰片對(duì)其調(diào)控的效果和機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　通過建立體外血腫瘤屏障模型(blood-tumor barrier，BTB)，研究天然冰片開放血腫瘤屏障模型的時(shí)效、量效關(guān)系及對(duì)緊密連接蛋白的調(diào)控作用;進(jìn)一步結(jié)合在體動(dòng)物模型上，研究天然冰片提高抗腫瘤藥物透過血腫瘤屏障的藥效學(xué)研究，闡明天然冰片調(diào)節(jié)血腫瘤屏障開放的效果和機(jī)制，為臨床上神經(jīng)膠質(zhì)瘤等顱內(nèi)疾病的治療開辟一條新的途徑。
　　方法:
　　1.體外BTB細(xì)胞模型的建立
　　大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞和人臍

2、靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)非接觸共培養(yǎng)建立體外BTB細(xì)胞模型，采用內(nèi)皮細(xì)胞跨膜阻抗(TEER)及HRP流量對(duì)模型性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　2.天然冰片藥材中右旋龍腦的含量測(cè)定
　　采用氣相色譜法測(cè)定天然冰片藥材中右旋龍腦的含量。GC條件為:色譜柱:ZB-WAX毛細(xì)管柱(30m×0.25mm×0.25μm);柱溫:梯度升溫，90℃保留2min，以10℃/min上升至110℃，保留2min，以30℃/min上升至160℃，保留2min

3、;進(jìn)樣口:210℃;FID檢測(cè)器溫度:250℃;高純氮?dú)鈮毫?5psi;分流比:10∶1;空氣流速:450mL/min;氫氣流速:45mL/min;進(jìn)樣量:1μL。
　　3.天然冰片對(duì)體外血腫瘤屏障模型通透性及緊密連接相關(guān)蛋白表達(dá)的影響
　　實(shí)驗(yàn)分4組:空白對(duì)照組、冰片低劑量組(25μg/mL)、冰片中劑量組(50μg/mL)、冰片高劑量組（100μg/mL），每組3個(gè)復(fù)孔。HRP流量測(cè)定不同劑量天然冰片對(duì)體外BTB細(xì)胞模型

4、通透性的影響:免疫熒光及ELISA方法測(cè)定Claudin-5、Occludin、ZO-1、F-actin的蛋白表達(dá)及分布變化。
　　4.大鼠C6腦膠質(zhì)瘤在體模型的制備
　　SD大鼠禁食不禁水12h，10％水合氯醛(3.5mg/kg)腹腔注射麻醉，腦右側(cè)尾狀核狀處注射C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞2.5×106（25μL），無菌骨蠟封閉骨孔，縫合皮膚，切口消毒，常規(guī)飼養(yǎng)。
　　5.天然冰片對(duì)甲氨蝶呤在C6腦膠質(zhì)瘤模型大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)及腦組

5、織分布的影響
　　制備成功的C6腦膠質(zhì)瘤模型大鼠隨機(jī)分為溶媒對(duì)照組（0.5％羧甲基纖維素鈉）、冰片低劑量組(35mg/kg)、冰片高劑量組(140mg/kg)，每組28只。灌胃給藥(10mL/kg)，1h后，3組大鼠均尾靜脈注射甲氨蝶呤(20mg/kg)。于甲氨蝶呤注射后的不同時(shí)間點(diǎn)取血及腦腫瘤組織，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)血漿和腦組織的樣本均為4只大鼠。
　　色譜條件:色譜柱:Synergi Hydro-RP C18(250mm×4.6

6、mm，4μm);流動(dòng)相:甲醇-0.3％冰醋酸/0.25％三乙胺溶液(26:74);流速:1mL/min;自動(dòng)進(jìn)樣器溫度:4℃;柱溫:35℃;檢測(cè)波長(zhǎng):302nm。
　　結(jié)果:
　　1.成功建立了體外BTB細(xì)胞模型，較好地反映了體內(nèi)的情況，可用于模擬體內(nèi)環(huán)境，用于藥物跨血腫瘤屏障特性方面的研究。
　　2.本實(shí)驗(yàn)所使用的天然冰片中右旋龍腦含量達(dá)到97.027％，符合中國藥典2010年版一部規(guī)定，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

7、　　3.HRP流量測(cè)定天然冰片對(duì)體外BTB細(xì)胞模型通透性的影響，結(jié)果顯示:與空白對(duì)照組相比，天然冰片低劑量組(25μg/mL)、中劑量組（50μg/mL）、高劑量組（100μg/mL）的HRP通透率均隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸提高，其中與空白組各相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)相比天然冰片低劑量組在10、30、60、120、240min時(shí)，通透率明顯提高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);中、高劑量組全部時(shí)間點(diǎn)的通透率明顯高于空白組各相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的通透率，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)

8、意義;從不同組同一時(shí)間點(diǎn)的通透率可以看出，呈現(xiàn)劑量依賴趨勢(shì)，高劑量組（各時(shí)間點(diǎn)通透率）＞中劑量組（各時(shí)間點(diǎn)通透率）＞低劑量組（各時(shí)間點(diǎn)通透率）。從相鄰時(shí)間點(diǎn)的透過率差值分析，低、中、高劑量組均在10-30min、30-60min時(shí)，HRP透過率提升最明顯，60-120min時(shí)通透率增加幅度降低，120-240min時(shí)，通透率恢復(fù)正常水平。
　　4.ELISA方法及免疫熒光法測(cè)定體外血腫瘤屏障上緊密連接相關(guān)蛋白Claudin-5、O

9、ccludin、ZO-1、F-actin的表達(dá)變化。ELISA測(cè)定結(jié)果顯示:Claudin-5蛋白的表達(dá)量隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)先降低，然后又逐漸升高恢復(fù)至藥前水平，在30min時(shí)表達(dá)量最低，并且在30、60min時(shí)間點(diǎn)存在劑量依賴性，高劑量（Claudin-5）＜中劑量(Claudin-5)＜低劑量(Claudin-5)＜藥前（Claudin-5）。Occludin蛋白不同時(shí)間點(diǎn)間及不同組別間沒有顯著性的變化，表明天然冰片在25μg/mL-

10、100μg/mL劑量范圍內(nèi)，作用于BTB細(xì)胞模型4h，對(duì)Occludin蛋白的表達(dá)沒有顯著性的影響(P＞0.05)。天然冰片低劑量給藥后，ZO-1蛋白各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量與給藥前相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);中、高劑量組ZO-1蛋白表達(dá)量先降低后又逐漸升高，且分別在60、30min時(shí)表達(dá)量最低(P＜0.01)。F-actin蛋白，各組表達(dá)量均先降低后逐漸升高，在30、60min時(shí)各組蛋白量顯著低于藥前表達(dá)量，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并在

11、30、60min時(shí)各組F-actin蛋白量存在劑量依賴趨勢(shì)高劑量（F-actin）＜中劑量(F-actin)＜低劑量(F-act＜藥前(F-actin)。免疫熒光法測(cè)定的四個(gè)蛋白的表達(dá)變化與ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。
　　5.成功制備大鼠C6腦膠質(zhì)瘤模型，并建立了測(cè)定血漿及腦組織勻漿液中甲氨蝶呤含量的HPLC法。與溶媒對(duì)照組比較，冰片高、低劑量組血漿中甲氨蝶呤AUC0-t，AUC0-∞均顯著降低(P＜0.01);冰片高劑量組腦腫

12、瘤組織中甲氨蝶呤AUC0-t，AUC0-∞顯著升高(P＜0.05)，冰片低劑量組腦腫瘤組織中甲氨蝶呤AUC0-t，AUC0-∞亦有升高趨勢(shì)，但與溶媒對(duì)照組比較無顯著差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論
　　天然冰片通過調(diào)控相關(guān)緊密連接蛋白Claudin-5、ZO-1、F-actin的表達(dá)和分布的改變，從而調(diào)節(jié)體外BTB細(xì)胞模型的通透性;在體實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了天然冰片能夠調(diào)節(jié)血腫瘤屏障的通透性，提高提高抗腫瘤藥物甲氨蝶呤的腦組織生物