鉛在體外血腦屏障模型跨膜轉(zhuǎn)運機制的探討.pdf

1、研究背景：
　　鉛是環(huán)境中普遍存在的污染物，在體內(nèi)可以長期蓄積，對人體可以產(chǎn)生全身性多系統(tǒng)的損傷。它具有很強的神經(jīng)親和性，可在神經(jīng)組織中蓄積，引起神經(jīng)系統(tǒng)功能長期的不可逆的損害。近些年發(fā)現(xiàn)，鉛的毒性作用沒有安全閾值，即體內(nèi)有鉛便有毒。在人群中更為普遍的是慢性低水平鉛中毒。雖然許多國家采取了一些降低環(huán)境鉛污染的措施，但慢性鉛中毒依然是現(xiàn)代城市的居民所面臨的主要健康問題之一。
　　血腦屏障（BBB）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要結(jié)構(gòu)，它保

2、證了中樞神經(jīng)系統(tǒng)所需內(nèi)環(huán)境的高度穩(wěn)定，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常進行各項機能活動的基礎(chǔ)；同時，BBB結(jié)構(gòu)和/或功能的變化也是許多疾病病理生理變化的核心過程。鉛不僅可以誘導腦微循環(huán)損傷改變腦血管內(nèi)皮細胞的膜結(jié)構(gòu)和緊密連接，使未成熟大腦的BBB發(fā)生滲漏，還可能通過腦內(nèi)皮細胞的胞飲作用增強攝入大量的鉛。近些年的研究顯示，二價鐵離子的跨膜轉(zhuǎn)運體（divalentmetaltransporter1,DMT1/NRAMP2/DCT1）也是鉛的結(jié)合底物，并且

3、鉛與DMT1的親和力比鐵高。提示，在BBB鉛可以競爭性抑制細胞鐵的吸收來干擾細胞內(nèi)鐵的平衡，或者取代鐵與鐵結(jié)合蛋白結(jié)合來干擾這些蛋白質(zhì)的功能。
　　本實驗為了克服在體研究不能施加干預措施的局限性，通過對體外BBB模型的建立，進一步研究內(nèi)皮細胞跨膜轉(zhuǎn)運鉛的具體機制以及與胞內(nèi)鐵平衡的關(guān)系，為闡明鉛在血腦屏障轉(zhuǎn)運的分子機制以及有效地采取防護措施提供新的理論依據(jù)和可行的途徑。
　　研究目的：
　　通過人臍靜脈內(nèi)皮細胞（ECV3

4、04）和小鼠膠質(zhì)瘤細胞（C6）共培養(yǎng)建立體外BBB模型，從細胞水平上研究鉛跨膜轉(zhuǎn)運與細胞內(nèi)鐵含量變化的關(guān)系，以探索鉛在BBB跨膜轉(zhuǎn)運的途徑及其可能的調(diào)控機制。
　　研究方法：
　　1、用ECV304和C6細胞建立Transwell非接觸式共培養(yǎng)體外BBB模型，測定跨內(nèi)皮阻抗（Trans-endotheilalelectricalresistance,TEER）和FITC-葡聚糖通過量來評價BBB的功能。
　　2、用鎢舟

5、原子吸收法測定鉛在體外BBB模型轉(zhuǎn)運的動力學特征；用免疫細胞染色法檢測DMT1(IRE)蛋白在細胞內(nèi)的定位；Westernblot法檢測細胞內(nèi)DMT1(IRE)蛋白的表達水平；用DFX誘導細胞低鐵來研究鉛是否影響細胞內(nèi)鐵的平衡。
　　3、反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染干擾DMT1mRNA和蛋白的表達；穩(wěn)定高表達DMT1細胞的篩選；進一步用這兩種細胞構(gòu)建體外BBB模型以確定DMT1是否是鉛進入內(nèi)皮細胞的主要通路。
　　4、Westernbl

6、ot法檢測細胞內(nèi)IRP1和p-ERK1/2蛋白的表達水平；免疫共沉淀和免疫細胞化學雙染法鑒定IRP1和p-ERK1/2蛋白之間是否存在相互作用；用ERK1/2通路的阻斷劑（PD98059）研究IRP1和p-ERK1/2蛋白的相互作用與細胞中DMT1(IRE)蛋白表達調(diào)控的關(guān)系；鎢舟原子吸收法測定PD98059對體外BBB模型轉(zhuǎn)運鉛的影響。
　　研究結(jié)果：
　　1、ECV304和C6細胞非接觸式共培養(yǎng)建立體外BBB模型

7、　　ECV-304在C6膠質(zhì)細胞的作用下，細胞間可以形成廣泛的緊密連接復合體進而抑制外加電場下電流的跨內(nèi)皮運動，產(chǎn)生了達232.5?cm2的TEER值；并且Papp均數(shù)在4、5、6d時均明顯低于內(nèi)皮細胞單獨培養(yǎng)組，差異有顯著性意義（p<0.05），說明我們建立了一種接近在體狀態(tài)的體外血腦屏障模型。
　　2、鉛在BBB模型中的轉(zhuǎn)運具有主動轉(zhuǎn)運的特點
　　鉛的轉(zhuǎn)運受pH值、溫度、時間和劑量的影響。隨著時間的增加，鉛的轉(zhuǎn)運量呈較為

8、明顯的上升趨勢；并且鉛的轉(zhuǎn)運量隨著鉛劑量的增加而增加；在pH5.5的條件下轉(zhuǎn)運鉛的量顯著高于pH7.4條件下的轉(zhuǎn)運量；37℃時鉛的轉(zhuǎn)運量顯著高于4℃時的轉(zhuǎn)運量（p<0.05）。提示鉛在BBB的轉(zhuǎn)運是以主動轉(zhuǎn)運為主。
　　3、鉛誘導的跨膜轉(zhuǎn)運增加是BBB通透性異常改變的主要原因
　　1μM和5μMPb(NO3)2對體外BBB模型中ECV304細胞形成的TEER和Papp均沒用顯著的影響（p>0.05），對內(nèi)皮細胞緊密連接蛋白c

9、laudin-1、ZO-1和occludinmRNA也沒有明顯的改變。鉛可增加ECV304細胞中DMT1(IRE)蛋白的表達，主要是顯著增加了DMT1(IRE)在細胞膜上的表達量；不同時間染鉛可以增加ECV304細胞中DMT1(IRE)蛋白表達，而DMT1(IRE)在細胞膜上表達的增加更為明顯。結(jié)果提示，鉛轉(zhuǎn)運量的增加主要與跨膜轉(zhuǎn)運異常密切相關(guān)。
　　4、鉛誘導的跨膜轉(zhuǎn)運異常增加與DMT1蛋白高表達及其膜定位密切相關(guān)
　　3

10、0μMFeCl3沒有顯著降低鉛的轉(zhuǎn)運（p>0.05）；150μMFeCl3在4h和24h可以顯著降低鉛的轉(zhuǎn)運（p<0.05）。鉛和DFX都增加了細胞總蛋白和膜蛋白中DMT1(IRE)的表達；鐵卻可以降低鉛誘導的DMT1(IRE)的表達。鉛和鐵均沒有顯著影響DMT1(IRE)mRNA的表達。用反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染以降低DMT1(IRE)蛋白的表達，可以降低BBB模型轉(zhuǎn)運鉛量，10h有顯著性差異（p<0.05）。轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-DMT1重

11、組質(zhì)粒后，用G418篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的ECV-304細胞與C6細胞共培養(yǎng)建立模型，可以增加鉛的轉(zhuǎn)運量；4h和24h有顯著性差異（p<0.05）。以上結(jié)果提示，DMT1蛋白是鉛跨膜轉(zhuǎn)運的主要載體，細胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)的失衡是鉛轉(zhuǎn)運增加的主要誘因之一。
　　5、IRP1與p-ERK1/2之間的相互作用可以負反饋調(diào)節(jié)DMT1蛋白的表達
　　鉛在2h增加了細胞漿和細胞膜IRP1蛋白的表達，以后逐漸降低；鉛還可以活化ERK1/2

12、蛋白，而胞漿內(nèi)ERK1/2的磷酸化卻顯著降低。鉛和DFX都增加了細胞中IRP1和p-ERK1/2的表達；鐵卻可以抑制鉛誘導的細胞漿IRP1和p-ERK1/2的高表達。共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示，細胞內(nèi)IRP1與p-ERK1/2之間存在共定位，主要分布在細胞漿。鉛和DFX都可以降低胞漿內(nèi)IRP1與p-ERK1/2相互重疊的區(qū)域；鐵卻可以增加胞漿內(nèi)IRP1與p-ERK1/2的相互重疊。免疫共沉淀結(jié)果顯示，鉛可增加相互作用的IRP1的表達，降低細胞

13、漿內(nèi)相互作用的p-ERK1/2。ERK阻斷劑（PD98059）有增加總細胞DMT1(IRE)和胞漿IRP1蛋白的表達作用。加入PD98059，體外BBB模型的鉛轉(zhuǎn)運量增加，10h時有顯著性差異（p<0.05）。以上結(jié)果提示，IRP1與p-ERK1/2之間的相互作用可以負反饋調(diào)節(jié)DMT1蛋白的表達。
　　研究結(jié)論：
　　1、BBB通過DMT1(IRE)介導的跨膜轉(zhuǎn)運增加鉛的轉(zhuǎn)運；
　　2、DMT1(IRE)蛋白是介導鉛轉(zhuǎn)