鉛在體外血腦屏障模型跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的探討.pdf

1、研究背景：
　　鉛是環(huán)境中普遍存在的污染物，在體內(nèi)可以長(zhǎng)期蓄積，對(duì)人體可以產(chǎn)生全身性多系統(tǒng)的損傷。它具有很強(qiáng)的神經(jīng)親和性，可在神經(jīng)組織中蓄積，引起神經(jīng)系統(tǒng)功能長(zhǎng)期的不可逆的損害。近些年發(fā)現(xiàn)，鉛的毒性作用沒有安全閾值，即體內(nèi)有鉛便有毒。在人群中更為普遍的是慢性低水平鉛中毒。雖然許多國(guó)家采取了一些降低環(huán)境鉛污染的措施，但慢性鉛中毒依然是現(xiàn)代城市的居民所面臨的主要健康問題之一。
　　血腦屏障（BBB）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要結(jié)構(gòu)，它保

2、證了中樞神經(jīng)系統(tǒng)所需內(nèi)環(huán)境的高度穩(wěn)定，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常進(jìn)行各項(xiàng)機(jī)能活動(dòng)的基礎(chǔ)；同時(shí)，BBB結(jié)構(gòu)和/或功能的變化也是許多疾病病理生理變化的核心過程。鉛不僅可以誘導(dǎo)腦微循環(huán)損傷改變腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)和緊密連接，使未成熟大腦的BBB發(fā)生滲漏，還可能通過腦內(nèi)皮細(xì)胞的胞飲作用增強(qiáng)攝入大量的鉛。近些年的研究顯示，二價(jià)鐵離子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)體（divalentmetaltransporter1,DMT1/NRAMP2/DCT1）也是鉛的結(jié)合底物，并且

3、鉛與DMT1的親和力比鐵高。提示，在BBB鉛可以競(jìng)爭(zhēng)性抑制細(xì)胞鐵的吸收來干擾細(xì)胞內(nèi)鐵的平衡，或者取代鐵與鐵結(jié)合蛋白結(jié)合來干擾這些蛋白質(zhì)的功能。
　　本實(shí)驗(yàn)為了克服在體研究不能施加干預(yù)措施的局限性，通過對(duì)體外BBB模型的建立，進(jìn)一步研究?jī)?nèi)皮細(xì)胞跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)鉛的具體機(jī)制以及與胞內(nèi)鐵平衡的關(guān)系，為闡明鉛在血腦屏障轉(zhuǎn)運(yùn)的分子機(jī)制以及有效地采取防護(hù)措施提供新的理論依據(jù)和可行的途徑。
　　研究目的：
　　通過人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（ECV3

4、04）和小鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞（C6）共培養(yǎng)建立體外BBB模型，從細(xì)胞水平上研究鉛跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)與細(xì)胞內(nèi)鐵含量變化的關(guān)系，以探索鉛在BBB跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的途徑及其可能的調(diào)控機(jī)制。
　　研究方法：
　　1、用ECV304和C6細(xì)胞建立Transwell非接觸式共培養(yǎng)體外BBB模型，測(cè)定跨內(nèi)皮阻抗（Trans-endotheilalelectricalresistance,TEER）和FITC-葡聚糖通過量來評(píng)價(jià)BBB的功能。
　　2、用鎢舟

5、原子吸收法測(cè)定鉛在體外BBB模型轉(zhuǎn)運(yùn)的動(dòng)力學(xué)特征；用免疫細(xì)胞染色法檢測(cè)DMT1(IRE)蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位；Westernblot法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)DMT1(IRE)蛋白的表達(dá)水平；用DFX誘導(dǎo)細(xì)胞低鐵來研究鉛是否影響細(xì)胞內(nèi)鐵的平衡。
　　3、反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染干擾DMT1mRNA和蛋白的表達(dá)；穩(wěn)定高表達(dá)DMT1細(xì)胞的篩選；進(jìn)一步用這兩種細(xì)胞構(gòu)建體外BBB模型以確定DMT1是否是鉛進(jìn)入內(nèi)皮細(xì)胞的主要通路。
　　4、Westernbl

6、ot法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)IRP1和p-ERK1/2蛋白的表達(dá)水平；免疫共沉淀和免疫細(xì)胞化學(xué)雙染法鑒定IRP1和p-ERK1/2蛋白之間是否存在相互作用；用ERK1/2通路的阻斷劑（PD98059）研究IRP1和p-ERK1/2蛋白的相互作用與細(xì)胞中DMT1(IRE)蛋白表達(dá)調(diào)控的關(guān)系；鎢舟原子吸收法測(cè)定PD98059對(duì)體外BBB模型轉(zhuǎn)運(yùn)鉛的影響。
　　研究結(jié)果：
　　1、ECV304和C6細(xì)胞非接觸式共培養(yǎng)建立體外BBB模型

7、　　ECV-304在C6膠質(zhì)細(xì)胞的作用下，細(xì)胞間可以形成廣泛的緊密連接復(fù)合體進(jìn)而抑制外加電場(chǎng)下電流的跨內(nèi)皮運(yùn)動(dòng)，產(chǎn)生了達(dá)232.5?cm2的TEER值；并且Papp均數(shù)在4、5、6d時(shí)均明顯低于內(nèi)皮細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)組，差異有顯著性意義（p<0.05），說明我們建立了一種接近在體狀態(tài)的體外血腦屏障模型。
　　2、鉛在BBB模型中的轉(zhuǎn)運(yùn)具有主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)的特點(diǎn)
　　鉛的轉(zhuǎn)運(yùn)受pH值、溫度、時(shí)間和劑量的影響。隨著時(shí)間的增加，鉛的轉(zhuǎn)運(yùn)量呈較為

8、明顯的上升趨勢(shì)；并且鉛的轉(zhuǎn)運(yùn)量隨著鉛劑量的增加而增加；在pH5.5的條件下轉(zhuǎn)運(yùn)鉛的量顯著高于pH7.4條件下的轉(zhuǎn)運(yùn)量；37℃時(shí)鉛的轉(zhuǎn)運(yùn)量顯著高于4℃時(shí)的轉(zhuǎn)運(yùn)量（p<0.05）。提示鉛在BBB的轉(zhuǎn)運(yùn)是以主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)為主。
　　3、鉛誘導(dǎo)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)增加是BBB通透性異常改變的主要原因
　　1μM和5μMPb(NO3)2對(duì)體外BBB模型中ECV304細(xì)胞形成的TEER和Papp均沒用顯著的影響（p>0.05），對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白c

9、laudin-1、ZO-1和occludinmRNA也沒有明顯的改變。鉛可增加ECV304細(xì)胞中DMT1(IRE)蛋白的表達(dá)，主要是顯著增加了DMT1(IRE)在細(xì)胞膜上的表達(dá)量；不同時(shí)間染鉛可以增加ECV304細(xì)胞中DMT1(IRE)蛋白表達(dá)，而DMT1(IRE)在細(xì)胞膜上表達(dá)的增加更為明顯。結(jié)果提示，鉛轉(zhuǎn)運(yùn)量的增加主要與跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)異常密切相關(guān)。
　　4、鉛誘導(dǎo)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)異常增加與DMT1蛋白高表達(dá)及其膜定位密切相關(guān)
　　3

10、0μMFeCl3沒有顯著降低鉛的轉(zhuǎn)運(yùn)（p>0.05）；150μMFeCl3在4h和24h可以顯著降低鉛的轉(zhuǎn)運(yùn)（p<0.05）。鉛和DFX都增加了細(xì)胞總蛋白和膜蛋白中DMT1(IRE)的表達(dá)；鐵卻可以降低鉛誘導(dǎo)的DMT1(IRE)的表達(dá)。鉛和鐵均沒有顯著影響DMT1(IRE)mRNA的表達(dá)。用反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染以降低DMT1(IRE)蛋白的表達(dá)，可以降低BBB模型轉(zhuǎn)運(yùn)鉛量，10h有顯著性差異（p<0.05）。轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-DMT1重

11、組質(zhì)粒后，用G418篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的ECV-304細(xì)胞與C6細(xì)胞共培養(yǎng)建立模型，可以增加鉛的轉(zhuǎn)運(yùn)量；4h和24h有顯著性差異（p<0.05）。以上結(jié)果提示，DMT1蛋白是鉛跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的主要載體，細(xì)胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)的失衡是鉛轉(zhuǎn)運(yùn)增加的主要誘因之一。
　　5、IRP1與p-ERK1/2之間的相互作用可以負(fù)反饋調(diào)節(jié)DMT1蛋白的表達(dá)
　　鉛在2h增加了細(xì)胞漿和細(xì)胞膜IRP1蛋白的表達(dá)，以后逐漸降低；鉛還可以活化ERK1/2

12、蛋白，而胞漿內(nèi)ERK1/2的磷酸化卻顯著降低。鉛和DFX都增加了細(xì)胞中IRP1和p-ERK1/2的表達(dá)；鐵卻可以抑制鉛誘導(dǎo)的細(xì)胞漿IRP1和p-ERK1/2的高表達(dá)。共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示，細(xì)胞內(nèi)IRP1與p-ERK1/2之間存在共定位，主要分布在細(xì)胞漿。鉛和DFX都可以降低胞漿內(nèi)IRP1與p-ERK1/2相互重疊的區(qū)域；鐵卻可以增加胞漿內(nèi)IRP1與p-ERK1/2的相互重疊。免疫共沉淀結(jié)果顯示，鉛可增加相互作用的IRP1的表達(dá)，降低細(xì)胞

13、漿內(nèi)相互作用的p-ERK1/2。ERK阻斷劑（PD98059）有增加總細(xì)胞DMT1(IRE)和胞漿IRP1蛋白的表達(dá)作用。加入PD98059，體外BBB模型的鉛轉(zhuǎn)運(yùn)量增加，10h時(shí)有顯著性差異（p<0.05）。以上結(jié)果提示，IRP1與p-ERK1/2之間的相互作用可以負(fù)反饋調(diào)節(jié)DMT1蛋白的表達(dá)。
　　研究結(jié)論：
　　1、BBB通過DMT1(IRE)介導(dǎo)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)增加鉛的轉(zhuǎn)運(yùn)；
　　2、DMT1(IRE)蛋白是介導(dǎo)鉛轉(zhuǎn)