魚源無乳鏈球菌小鼠血腦屏障開放評估模型的建立及cas9基因功能分析.pdf

1、無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae），亦稱B群鏈球菌(Group BStreptococcus，GBS)，具有廣泛的宿主感染范圍，不僅能引起新生兒腦膜炎及肺炎和奶牛乳腺炎，還可引致魚類腦膜炎和敗血癥。近年來，無乳鏈球菌已成為魚類重要致病菌之一，其傳染性強，死亡率高，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成慘重經(jīng)濟損失，嚴重制約了我國羅非魚養(yǎng)殖業(yè)的穩(wěn)定發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，無乳鏈球菌對魚類的致死率可達100％，但其致病機制尚不清楚。因此，研究

2、其致病機制對防控魚類無乳鏈球菌病至關(guān)重要。
　　1魚源無乳鏈球菌小鼠血腦屏障開放評估模型的建立
　　本試驗篩選出一株產(chǎn)β-半乳糖苷酶大腸桿菌M5，毒力測定得知其對小鼠半數(shù)致死量(LD50)＞2×109CFU;各臟器細菌載量分析表明，該菌不能穿透血腦屏障(BBB)進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，因此該菌可作為小鼠血腦屏障開放程度的指示菌。在此基礎(chǔ)上，對小鼠腹腔注射100μL濃度為103CFU/mL的無乳鏈球菌GD201008-001，并于注

3、射后3h、6h、9h和12h，通過尾靜脈注射大腸桿菌M5100μL(2×108CFU)，于5min后眼球采血并處死小鼠，無菌取腦，涂板計數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腦組織中的無乳鏈球菌和大腸桿菌M5都隨感染時間的延長而增加，證明該模型穩(wěn)定性良好，為細菌性腦膜炎致病機制的研究提供了實用可靠的工具。
　　2魚源無乳鏈球菌透明質(zhì)酸酶的表達及其對小鼠的致病作用
　　為了確定透明質(zhì)酸酶(hyaluronidase，Hyl)在魚源無鏈球菌穿透血腦屏障

4、引起腦膜炎過程中的作用，根據(jù)實驗室分離并公布在GenBank上的羅非魚源無乳鏈球菌的全基因組序列，設(shè)計hylB特異性引物，采用PCR技術(shù)擴增長為3156bp的hylB基因片段。用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和XhoⅠ消化后將該片段克隆至表達載體pET32a(+)，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET32a(+)-hylB，經(jīng)雙酶切、測序鑒定后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中，進行體外原核表達，獲得有透明質(zhì)酸酶活性的137.1kD目的蛋白。經(jīng)鎳離子親和層析

5、柱純化后，注射ICR小鼠，在不同時間點處死小鼠，無菌取心、肝、脾、肺、腎和腦制作病理切片，顯微鏡下觀察到心、肝和腎無明顯病變;脾臟表現(xiàn)輕微出血;肺組織病變嚴重，表現(xiàn)為血管破裂，內(nèi)皮細胞松散，肺間質(zhì)增厚，肺實變;腦組織有大量小膠質(zhì)細胞浸潤，腦微血管出血，血管內(nèi)皮細胞腫脹脫落。研究表明，Hyl在魚源無乳鏈球菌引致肺炎和破壞血腦屏障引起腦膜炎過程中發(fā)揮重要作用。
　　3魚源無乳鏈球菌cas9基因缺失株的構(gòu)建
　　為了明確cas9基

6、因?qū)o乳鏈球菌毒力的影響，根據(jù)公布在GenBank上的魚源無乳鏈球菌GD201008-001株的基因組，設(shè)計cas9基因的上下游引物，通過PCR技術(shù)擴增其上下游片段，然后通過融合PCR方法融合擴增所得的上下游同源臂。將上下游同源臂連接至溫敏型自殺質(zhì)粒pSET-4s。通過電擊轉(zhuǎn)化將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入GD201008-001株進行同源重組，通過抗性和溫度篩選出cas9基因缺失株。將含有啟動子的目的基因片段連入鏈球菌-大腸桿菌穿梭質(zhì)粒pSET2，再

7、轉(zhuǎn)入缺失株，構(gòu)建互補株。通過常規(guī)PCR、基因測序及熒光定量PCR檢測目的基因在親本株，缺失株和互補中的mRNA轉(zhuǎn)錄水平，證明cas9基因缺失株和互補株構(gòu)建成功，為后續(xù)的生物學特性分析奠定了基礎(chǔ)。
　　4魚源無乳鏈球菌cas9基因缺失株的特性分析
　　為了進一步研究魚源無乳鏈球菌cas9基因的功能，試驗比較了野生株、缺失株和互補株在生物體內(nèi)外的特性差異。研究發(fā)現(xiàn)，3株菌生長曲線無顯著差異;小鼠巨噬細胞對cas9基因缺失株的吞噬

8、率高于野生株和互補株，但差異不顯著;相比于野生株和互補株，cas9基因缺失株對bEnd.3細胞的黏附率顯著下降。缺失株對斑馬魚的LD50顯著高于野生株和互補株;對小鼠的LD50有所升高，與野生株和互補株無顯著差異，但小鼠死亡時間推遲12h。將培養(yǎng)至OD600約為0.6的3株菌(103CFU/mL)100μL及200μL Hyl蛋白(2.0mg/mL)注射小鼠，分別在注射3h、6h、9h和12h后尾靜脈注射大腸桿菌M5(2×108CFU)

9、，10min后眼球采血，并處死小鼠，無菌取腦，勻漿后10倍比稀釋涂至THB和M63培養(yǎng)基平板。計數(shù)結(jié)果表明，3株菌在誘導BBB開放的時間上明顯不同，感染野生株和互補株6h后小鼠BBB開放，而攻毒缺失株Δcas99h后BBB開放;在攻毒后9h至12h，野生株和互補株攻毒組穿過BBB的無乳鏈球菌和大腸桿菌顯著高于缺失株組。攻毒Hyl蛋白后，BBB在3h時已開放，在攻毒后6h至9h，蛋白組與3株細菌組穿過BBB的大腸桿菌無明顯差異，而在12h